PMC

1 GST-geenin fuusioproteiinin ilmentymisjärjestelmän kaikkia näkökohtia koskevat yksityiskohtaiset protokollat ja vianmääritysvinkit ovat saatavilla GE Healthcare-palvelusta käsikirjoista: GST-geenien Fuusiojärjestelmä, tuotenumero 18-1157-58 ja rekombinantti Proteiinikäsikirja, tuotenumero 18-1142-75. Käsikirjat ovat ostettavissa paperiversiona tai saatavilla PDF: nä GE Healthcaren verkkosivuilla.

2vektorin kloonaukseen ja ylläpitoon suositellaan jm105: n tai vastaavan kannan käyttöä. Bl21-kantoja ja sen johdannaisia tai muuta proteaasinpuutoksesta kärsivää kantaa suositellaan proteiinin maksimaaliseen ilmentymiseen. Sytoplasmaisten proteaasigeenivalmisteiden puutteelliset kannat, kuten OMP, degP tai htpR, voivat minimoida isännän suorittaman yli-ilmentyvän proteiinin proteolyyttisen hajoamisen vaikutukset. Rec1A-alleelia kantavaa E. coli-kantaa ei saa käyttää pgex-plasmidien levittämiseen, sillä plasmidin DNA: n poistumia tai uudelleenjärjestelyjä on raportoitu.

3glutationi-Sefaroosi 4B-bulkkialustaa käytetään tässä puhdistusprotokollassa. Tämä kromatografialaite soveltuu erinomaisesti seulontaolosuhteisiin ja mahdollistaa helpon skaalauksen. Puhdistukset suoritetaan helposti joko painovoimavirran tai matalapaineisen kromatografiajärjestelmän avulla, tai niitä voidaan käyttää sentrifugointiin perustuvissa eräpuhdistuksissa. Gstrap FF affiniteettikolonnit ovat 1 ml: n tai 5 ml: n valmiiksi pakattuja kolonneja, jotka ovat myös saatavilla ja jotka voidaan liittää sarjaan skaalausta varten. Nämä kolonnit on tarkoitettu käytettäväksi nestekromatografisen järjestelmän, pumpun tai ruiskun kanssa. Näiden formaattien lisäksi glutationisefaroosia on saatavilla myös spin-sarakkeina ja 96-kuoppalevymuodossa GST: n fuusioproteiinin ekspression ja puhdistusolosuhteiden nopeaan seulontaan.

4DFP on erittäin vaarallinen hermomyrkky. Noudata valmistajan antamia varotoimia ja käsittele puhdasta reagenssia vain kemiallisessa savuhupussa.

5 proteaasinestäjien lisääminen lysis-puskuriin auttaa estämään kohdeproteiinin proteolyyttistä hajoamista uuttamisen aikana. Lysis-puskuriin lisättyjen proteaasinestäjien tarkka cocktail tulisi kuitenkin räätälöidä kohdeproteiinin ominaisuuksien mukaan. Puskuriin lisätään tarvittaessa pelkistäviä aineita, kuten 2-ME, DTT tai TCEP 1-10 mM: n pitoisuuksina. Puskuriin voidaan lisätä myös ionitonta pesuainetta, kuten 1% Triton X-100, uuttamisen helpottamiseksi.

6Following on seulontaprotokolla, jolla tarkistetaan fuusioproteiinin ilmentymistasot miniviljelmissä. Proteiinipitoisuuksien nousu odotetulla molekyylipainolla SDS-PAGE-geelissä iptg-induktion jälkeen on hyvä osoitus onnistuneesta proteiinin ilmentymisestä. Induktion jälkeen näkyvän kaistan pitäisi olla näkyvissä odotetulla molekyylipainolla (kohdeproteiinin molekyylipaino + ~ 26 KDa GST-osalle). Jos epäillään, että proteiini on ilmaistu alhaisella tasolla, oikea ilmentyminen voidaan varmistaa käyttämällä Western blottausta, jossa on vasta-aine, joka on spesifinen joko kohdeproteiinille tai GST: lle. Jos SDS-PAGE ei analysoi näytteitä välittömästi, ne voidaan säilyttää yön yli 4 °C: ssa tai -20 °C: ssa pidempiaikaista varastointia varten.

1. inokuloidaan useita eristettyjä pesäkkeitä erillisiin 50 ml: n sentrifugiputkiin, joissa on 10 ml LB ja 100 µg/ml ampisilliinia. Kasvata yön yli 37 °C: n lämpötilassa ravistelemalla.

2. lisätään seuraavana aamuna 0, 5 ml yön yli viljelyä 4, 5 ml: aan LB 100 µg/ml ampisilliinia. Kasvatetaan 1 h 37 °C: ssa.

3. poistetaan 1 ml indusoimatonta näytettä. Sentrifugoidaan ja poistetaan supernatantti. Jäädytä tai säilytä jäällä, kunnes SDS-PAGE on valmis.

4. lisätään IPTG: tä 1 mM: n lopulliseen pitoisuuteen ja kasvatetaan vielä 2-3 tuntia.

5. poistetaan 1 ml indusoitua näytettä. Sentrifugoidaan ja poistetaan supernatantti. Jäädytä tai säilytä jäällä, kunnes SDS-PAGE on valmis.

6. suspendoidaan solupelletit 200 µl: aan SDS-sivun näytepuskuria; kuumennetaan 3-5 min 90 °C: ssa.

7. analysoidaan 5-10 µl käyttäen SDS-sivua, jota seuraa Coomassie blue-värjäys (tai 1-2 µl Western blotille).

7miniviljelmissä kasvatettuja näytteitä voidaan käyttää myös tietyn fuusioproteiinin liukoisuuden arviointiin (Katso huomautus 6 miniviljelmän ilmaisuprotokollasta). Induktiojakson lopussa solut kerätään sentrifugoimalla. Sekoita sakka 200 µl: aan kylmää PBS: ää. Lyse solut käyttäen sonication; pitää näyte jäässä. Säästä pieni määrä lysaattia SDS-sivun analysoitavaksi. Lysähtänyttä näytettä sentrifugoidaan 15 minuutin ajan. Poista supernatantti erilliseen putkeen. Sekoita sakka uudelleen 200 µl PBS: ään. Erittele osa raa ’ asta lysaatista, supernatantista ja uudelleen suspendoidusta sakasta SDS-PAGE-tai Western blotting-menetelmällä. Jos näytteessä on sekä lysaatti-että supernatanttifraktio, näyte liukenee riittävästi. Jos näyte on pääasiassa lysaatissa ja uudelleen suspendoidussa sakassa, näyte on todennäköisimmin okkluusiokappaleissa. Jos proteiini sijaitsee inkluusioelimissä, tutkitaan erilaisia ilmentymisolosuhteita ilmentymän siirtämiseksi liukoiseen muotoon (KS.Huomautus 8).

8jos fuusioproteiini ilmaistaan ensisijaisesti inkluusioelimissä (esim. >80% liukenematon), liukoisuuden parantamiseksi voidaan käyttää erilaisia strategioita. Usein induktio alemmassa lämpötilassa (15-25 °C) on tehokas siirtämään ilmentymistä inkluusiokappaleista liukoiseen fraktioon. Alemmassa lämpötilassa indusoidut solut kasvavat hitaammin ja vaativat yön aikana induktiojaksoja. Vaihtoehtoisten isäntäkantojen käyttö tai plasmidirakenteeseen tehtävät muutokset voivat olla tarpeen joissakin tapauksissa. Jos fuusioproteiini pysyy pääasiassa inkluusioelimissä senkin jälkeen, kun liukoista proteiinia on yritetty saada, E: n tuotantoa voi olla syytä laajentaa. coli ja puhdistaa tarpeeksi proteiinia pienestä määrästä liukoista proteiinia, joka on saatavilla. Joissakin tapauksissa olisi tutkittava muita fuusioproteiinitunnisteita.

9 Alhainen proteiiniekspressiotaso voi olla seurausta harvinaisesta kodonin käytöstä. Tässä tapauksessa siirtyminen toiseen E. coli-kantaan, joka sisältää ylimääräisiä transkriptejä harvinaiselle kodoni tRNA: lle, voi parantaa merkittävästi proteiinin tuotantoa. Erilaiset väliainemuodot tai jopa 2% glukoosin lisääminen voivat myös parantaa ilmentymistä (13, 14). Jos epäillään, että ilmentyvä proteiini on myrkyllistä soluille (yleensä ne lakkaavat kasvamasta induktion jälkeen IPTG: llä), kokeile indusointia myöhemmässä vaiheessa lyhyemmän aikaa. IPTG-pitoisuuden pienentäminen on toinen vaihtoehto, jota olisi tutkittava.

10monitorisolun kasvu lukemalla optinen tiheys 600 nm: ssä (A600). Yön yli kulttuurin pitäisi saavuttaa A600 ~1-1. 2. Solut indusoidaan E. coli-bakteerin logaritmisen kasvukäyrän varhaisessa vaiheessa, A600 ~ 0,5-0,7. 37 °C: n lämpötilassa kestää noin 2 tuntia ennen kuin viljelmät saavuttavat aikaisen lokin kasvuvaiheen. Jos soluja kasvatetaan alemmassa lämpötilassa, inkubaatioaikaa on pidennettävä, koska solut kasvavat hitaammin alemmissa lämpötiloissa. Yleensä suurin fuusioproteiinin tuotto saadaan, kun solut indusoituvat A600 = ~ 0,5. Iptg-induktion jälkeen inkubaatioajan yleisohje on seuraava: 3 tuntia 37 °C: ssa, 5 tuntia 30 °C: ssa ja yön yli 25 °C: ssa tai sitä alemmassa lämpötilassa. Harvest solut ennen kylläisyyttä, A600 ~ 1.0-1.2.

11 riittävän ilmastuksen varmistamiseksi pulloja tulisi täyttää vain 20-30 prosenttia niiden tilavuudesta.

12 on tärkeää, ettei näytteessä ole seriiniproteaasin estäjiä ennen trombiinin tai hyytymistekijä Xa: n pilkkoutumista. Seuraavat proteaasinestäjät on poistettava ennen trombiinin tai hyytymistekijä Xa: n pilkkoutumista: AEBSF, APMSF, antitrombiini III, antipaiini, α1-antitrypsiini, aprotiniini, kymostatiini, hirudiini, leupeptiini ja PMSF. Lisäksi pefabloc TH bentsamidiini on spesifinen trombiinille ja Pefabloc FXa spesifinen tekijä Xa: lle. Prescissioproteaasin kanssa tulee välttää seuraavia proteaasinestäjiä: 100 mM ZnCl2, 100 µM kymostatiini ja 4 mM Pefabloc.

13 on olemassa useita vaihtoehtoisia menetelmiä GST-fuusioproteiinien havaitsemiseksi. Proteiineille, jotka ilmentävät hyvin korkealla tasolla, yksinkertaisin tapa valvoa puhdistusta on coomassien sinisellä tai hopealla värjätyillä SDS-SIVUGEELEILLÄ. Vaihtoehtona matalilla pitoisuuksilla ilmentyville proteiineille on käyttää Western blotting-menetelmää, jossa käytetään vasta-ainetta joko GST: lle tai kohdeproteiinille. Vaihtoehtona pienimuotoisille lausekkeille on seurata GST: n esiintymistä ELISA-tai CDNB-entsyymimäärityksellä.

14säilytä pieni määrä proteiininäytettä jokaisesta puhdistuksen vaiheesta, mukaan lukien hajoaminen, supernatantti, sakka, näytteen lastauksen sitoutumattomat fraktiot, pesu-ja eluutiovaiheet analysoitavaksi SDS-PAGE-tai Western blotting-menetelmällä. Kun kaikki näytteet on analysoitu ja yhdistetty, hylkää ei-toivotut fraktiot.

15gst proteiinit voidaan myös puhdistaa eräpuhdistusmenetelmällä. Eräpuhdistusmenetelmä on nopea, helppo ja vaatii vähän laitteita; syntyvä proteiini voi kuitenkin sisältää enemmän epäpuhtauksia ja sen saanto on pienempi kuin kromatografiaan perustuvassa puhdistuksessa. Eräpuhdistuksia hyödynnetään parhaiten puhdistusolosuhteiden seulonnassa. Seuraavassa esitetty eräpuhdistus suoritetaan yleensä huoneenlämmössä. Proteolyyttisen hajoamisen riskin minimoimiseksi toimenpide voidaan suorittaa 4 °C: n lämpötilassa lisäämällä inkubointiaikaa 2 – 4-kertaiseksi.

1. lyseota soluja ja hanki liukoinen fuusioproteiini (KS.8 ja 21 huomautusta, jos näyte on inkluusioelimissä).

2. lisätään 2 ml 50-prosenttista lieteliglutationisefaroosibulkkimatriisia (1 ml vuodetilavuutta) 100 ml: aan bakteerilysaatin supernatanttia. Inkuboidaan 30 min huoneenlämmössä kevyesti sekoittaen.

3. sentrifugoidaan 500 × g 5 minuutin ajan. Poista supernatantti ja tallenna SDS-sivun analyysiin sidontatehokkuuden määrittämiseksi.

4. pese hartsi 10 vuode tilavuudella PBS. Sekoita varovasti ja sentrifugoi 500 × g 5 minuutin ajan. Poista supernatantti. Toista pesu – ja sentrifugointivaiheet yhteensä 3 pesua 10 vuodetta kohden.

5. Fuusioproteiini eluoidaan sekoittamalla hartsi uudelleen 1, 0 ml: lla glutationieluutiopuskuria per ml: n tilavuus. Inkuboidaan 10 min huoneenlämmössä. Sentrifugoidaan 500 × g 5 minuutin ajan. Siirretään fuusioproteiinia sisältävä supernatantti erilliseen putkeen. Toista eluutiovaiheet ja keräysvaiheet yhteensä 3 kertaa. Supernatantit voidaan yhdistää tai analysoida erikseen SDS-sivulla proteiinipitoisuuden seuraamiseksi (KS.Huomautus 12).

16A vuode tilavuus on puolet 50% lietteen glutationi Sefaroosi 4B käytetään puhdistukseen. Valmistella 50% lietteen glutationi Sefaroosi (se toimitetaan ~ 75% lietteen): määrittää vuode tilavuus tarvitaan puhdistus mittakaavassa. Suspendoidaan glutationisefaroosi 4B. pipetoidaan 1, 33 ml 75-prosenttista lietettä sopivan kokoiseen sentrifugiputkeen jokaista vaadittua millilitraa kohden. Sentrifugoidaan 500 × g: n tarkkuudella 5 minuutin ajan. Dekantoi talonmies. Pestään 10 vuodetilavuudella (10 ml / 1, 33 ml alkuperäistä lietettä) PBS: ää kääntämällä putkea varovasti useita kertoja sekoittamista varten ja sentrifugoidaan 500 × g 5 minuutin ajan. Dekantoi talonmies. Jos etanolin varastointiliuosta ei poisteta, se voi häiritä myöhempiä sitomisvaiheita. Lisätään 1 ml PBS: ää kutakin 1, 33 ml: aa alkuperäistä lietettä kohti. Tuloksena on 50% lietettä.

17glutationi-Sefaroosi sitoutuu ilmoitetusti vähintään 8 mg/ml: aan. 20 ml: n kolonnin on oltava riittävä proteiinin puhdistamiseen 3 × 600 ml: n E. coli-viljelmistä, jotka sisältävät ~ 20-40 mg fuusioproteiinia viljelmää kohden. Sekä hartsin määrä että kolonnin koko voidaan skaalata ylös tai alas puhdistettavan proteiinin määrän mukaan.

18 suspendoi sakka käyttäen 25-50 µl pesupuskuria per ml alkuperäistä viljelyä.

19cell rikkoutuu, kun jousitus osittain kirkastuu ja muuttuu hieman tummemmaksi. Vältä vaahtoamista sonikaation aikana, koska se voi johtaa fuusioproteiinin denaturaatioon. Vältä liikasonikaatiota, koska tämä voi johtaa isäntäkolibakteerien ja GST-fuusioproteiinin yhteispuhdistukseen. Nukleiinihappojen vapautumisesta sonikaation aikana johtuvaa korkeaa viskositeettia voidaan vähentää lisäämällä dnaasia tai bentsoaasia lyysipuskuriin. Lysotsyymi 0-pitoisuuteen asti.2 mg/ml voidaan lisätä solujen hajoamisen apuna. Sonikaation vaihtoehtona on kaupallisesti saatavilla olevien soluuuttovalmisteiden käyttö. Nämä tuotteet voivat kuitenkin sisältää omia komponentteja, jotka häiritsevät tuotantoketjun loppupään sovelluksia.

20jos ekspressiota yritetään siirtää inkluusioelimistä liukoiseen fraktioon, liukenemattomat GST-fuusioproteiinit voidaan joskus puhdistaa denaturointiaineiden, kuten urean, läsnä ollessa, minkä jälkeen ne uudelleenoltetaan. Myös liukoisuus pesuaineiden, kuten sarkosyylin (n-lauryylisarosiini), avulla on onnistuttu (15, 16). Vaikka seuraavaa protokollaa on käytetty onnistuneesti GST-fuusioproteiinien denaturointiin ja uudelleenluontoon, jokainen fuusioproteiinikonstruktio on ainutlaatuinen ja tarkat denaturointi-ja uudelleen naturointiolosuhteet on määritettävä empiirisesti. Yleisiä denaturointiaineita, joita on käytetty onnistuneesti, ovat guanidiini HCl, urea, Tween 20, CTAB ja SDS (17, 18). Denaturointiaineet on sitten poistettava kokonaan, jotta valkuaisaine säilyy asianmukaisesti. Olosuhteet, jotka olisi optimoitava uudelleenoltamisen helpottamiseksi, ovat: denaturointiaineen tyyppi, pH, pelkistävän aineen esiintyminen, denaturointiaineen poistumisnopeus ja proteiinipitoisuus. Kun proteiini on uudelleen natured, tarkista, että proteiini on palannut sen natiivi rakenne ja toiminta ja poista väärin taitettu proteiini.

1. glutationisefaroosikolonni asetetaan Esitasapainoon; pelletoidut E. coli-solut sonikoidaan ja supernatantti ja pellettifraktiot erotetaan sentrifugoimalla (KS.kohta 3.3 Affiniteettipuhdistus GST-fuusioproteiinin vaiheista 1-8). Suspendoidaan uudelleen 15 ml: aan pesupuskuria sisältävää lysaattisellettiä. Sentrifugoidaan 20 min lämpötilassa 48 000 × g (4 °c). Supernatantti dekantoidaan ja pesty sakka suspendoidaan uudelleen 12 ml: aan U-puskuria (suspendoidaan uudelleen 20 µl: aan u-puskuria per ml alkuperäistä viljelmää). Hautoa 2 h jäällä.

2. sentrifugoidaan 20 min lämpötilassa 48 000 × g (4 °c). Siirretään denaturoitua fuusioproteiinia sisältävä supernatantti puhtaaseen sentrifugiputkeen.

3. lisätään Triton X-100 supernatanttiin 1%: n lopulliseksi pitoisuudeksi.

4. dialysoidaan näyte 2-3 tunnin ajan PBS/glyseroliin. dialyysipuskurin tilavuuden on oltava vähintään 20 kertaa näytetilavuus.

5. Dialysoi näyte yön yli proteaasinestäjiin verrattuna käyttämällä puskuritilavuutta, joka on >100 kertaa näytetilavuus.

6. näyte poistetaan dialyysistä ja sentrifugoidaan 20 minuutin välein 4 000 × g: n tarkkuudella.

7. inkluusiorungoista uutettu ja uudelleen luontuva proteiini voidaan nyt levittää glutationisefaroosipylväisiin ja puhdistaa.

ratkaisut:

Pesupuskuri: 50 mM Tris, 5 mM EDTA, 1 µg/ml leupeptiniä, 1 µg/ml pepstatiinia, 0, 15 mm PMSF, pH 8, 0

U puskuri: 5 M ureaa,50 mM Tris, 5 mM EDTA, 5 mM 2-ME, 1 µg/ml leupeptiniä, 1 µg/ml pepstatiinia, 0, 15 mM PMSF, 1 mM DFP pH 8, 0

PBS/glyseroli: 1x PBS, 20% glyserolia, 1% Tritonia x-100, 5 mm 2-me, 5 mm EDTA, 5 mm 2 – me, 1 µg/ml leupeptiniä, 1 µg/ml pepstatiinia, 0, 15 mm pmsf, 1 mm DFP pH 7, 4

21 peristalttisen pumpun käyttöä suositellaan tasaisesti säätelemään virtausnopeuksia. Jos hartsin puristuminen tapahtuu, paine on liian suuri ja virtausnopeutta on vähennettävä.

22 glutationin ja GST: n välinen sitoutumiskinetiikka on suhteellisen hidasta. Siksi on tärkeää käyttää alhaisia virtausnopeuksia maksimaalisen sitoutumiskyvyn saavuttamiseksi, esim. 0, 1 ml / min 2, 5 cm: n Id-kolonnissa. Liian nopeiden virtausnopeuksien käyttäminen saattaa vähentää sitoutuneen fuusioproteiinin määrää assosiaation hitaan kinetiikan vuoksi. Pesu-ja eluutiovaiheet voidaan suorittaa nopeammilla virtausnopeuksilla ajan säästämiseksi (1, 5 ml/min ja 0, 3 ml/min). Suurten tilavuusnäytteiden sitominen tapahtuu kätevimmin yön yli, jolloin virtausnopeuksia säädetään niin, ettei kolonni pääse kuivumaan.

23 sitoutumattomien fraktioiden analyysi osoittaa, sitoutuuko fuusioproteiini vai ei. Jos proteiinia ei havaita varhaisfraktioissa, mutta esiintyy myöhemmissä fraktioissa, se kertoo kolonnin kapasiteetin ylittyneen. Proteiinikuorman väheneminen tai sarakkeen koon kasvu lievittää tätä tilaa.

24jos fuusioproteiini sitoutuu huonosti glutationisefaroosiin, on olemassa useita vaihtoehtoja yrittää lisätä sitoutumistehokkuutta. Kokeile lievempää lyysimenetelmää. Jos käytetty menetelmä on liian kova, proteiini voi denaturoitua eikä siksi pysty sitoutumaan kolonniin. Jos valkuainen on uudelleenluonnistettu inkluusioelimistä, on varmistettava, että kaikki denaturointiaineet on poistettu puskurista joko tyhjentävällä dialyysillä tai antamalla näyte suolanpoistokolonniin ennen glutationikolonniin levittämistä. Etanolin varastointiliuos poistetaan glutationisefaroosista; kolonni pienennetään tuoreella glutationipuskurilla, minkä jälkeen se pestään PBS: llä juuri ennen näytteen lataamista. Lisätään hartsin määrää ja / tai pienennetään näytteen lataamiseen käytettävää virtausnopeutta. Kokeile lisätä näytteeseen 1-20 mM: n DTT. Jos ongelma jatkuu edelleen, puhdista kolonni valmistajan suosituksen mukaisesti. Jos sitominen ei ole vieläkään palautunut, kokeile tuoretta hartsia.

25 fuusioproteiinin saanto voidaan myös arvioida mittaamalla absorbanssi aallonpituudella 280 nm (A280). Pelkän GST-osan ekstinktiokerroin on ~ 1,5 eli 1,00 A280 = ~ 0.6 mg/ml proteiinia, vaikka fuusioproteiinin ekstinktiokerroin riippuu osittain kohdeproteiinin absorbanssiominaisuuksista.

26 jos glutationisefaroosipatsaan proteiinin eluointi on ongelmallista, yritä pienentää virtausnopeutta ja lisätä käytetyn eluutiopuskurin määrää. Muista käyttää tuoretta pelkistettyä glutationipuskuria (tee siitä päivä, jona sitä käytetään). Nosta glutationin pitoisuus jopa 40 mM: iin ja / tai nosta puskurin pH–arvo arvoon pH 8,0-9,0. Lisätään puskuriin 1-20 mM DTT: tä (tai muuta pelkistävää ainetta). Nonionisen pesuaineen lisääminen voi myös parantaa liukoisuutta ja minimoida mahdollisen aggregaation.

27 puhdistetun fuusioproteiinin sekoittuminen E. coli-isäntäsolun proteiineihin on osoitus siitä, että sonikaatio on ollut liian voimakasta. Jos fuusioproteiinin hajoavia fragmentteja on, yritä lisätä lysis-puskuriin lisää proteaasinestäjiä. Pidä kaikki näytteet, Puskurit ja keräysputket kylminä proteolyysin minimoimiseksi. Jos hajoamista tapahtuu proteiiniekspression aikana, yritä indusoida näyte myöhään (~0.8 OD600) ja lyhentää induktiojakson pituutta. Vaihto vaihtoehtoiseen isäntäkantaan voi myös auttaa.

28an vaihtoehto liuoksessa tapahtuvalle digestiolle on fuusioproteiinin proteaasi pilkkoutuminen sen sitoutuessa glutationi-sefaroosimatriisiin. Fuusioproteiini uutetaan ja Ladataan glutationisefaroosiin, minkä jälkeen se pestään PBS: llä (katso Affinity purification of GST fusion protein, vaiheet 1-11). Sen sijaan, että proteiinia eluoitaisiin glutationipuskurilla, entsyymiä sisältävä PBS-liuos Ladataan kolonniin ja inkuboidaan useita tunteja huoneenlämmössä (4 °C, Kun kyseessä on Prescissioproteaasi). Tämän jälkeen pilkottu proteiini pestään pois kolonnista, jossa on useita PBS: n kolonnimääriä. Jäljelle jäänyt fuusioproteiini ja GST-osa voidaan poistaa kolonnista pesemällä kolonni pelkistetyllä glutationipuskurilla. Entsyymin määrä ja inkubointiaika on määritettävä empiirisesti kullekin fuusioproteiinille. Analysoi kaikki näytteet SDS-sivun mukaan määrittääksesi pilkkoutumisen tehokkuuden ja proteiinin puhtauden.

29 eräkohtaisessa proteaasin pilkkoutumisessa lisätään empiirisesti määritetty määrä entsyymiä hartsiin sitoutuneeseen fuusioproteiiniin (KS.Huomautus 15 A–d). Käytetään 1 ml PBS: ää sisältävää entsyymiä per ml vuodetilavuutta. Inkuboidaan huoneenlämmössä useita tunteja kevyesti sekoittaen. Sentrifugoidaan 500 × g 5 minuutin ajan hartsin sedimentoimiseksi. Poista super, joka sisältää kohdeproteiinia erilliseen putkeen. Pese glutationisefaroosi PBS: llä jopa 3 kertaa, jotta pilkkoutunut fuusioproteiini saadaan takaisin. Hartsia inkuboidaan glutationipuskurilla GST: n ja fuusioproteiinin poistamiseksi. Käytä 1 ml glutationipuskuria per ml hartsia. Sentrifugoidaan 500 × g ja otetaan talteen eluoitu GST. Toista jopa 3 kertaa. Analysoi näytteet SDS-sivun mukaan.

30 jos trombiiniproteaasia käytetään, pilkkoutuminen voidaan suorittaa glutationipuskurissa, jota käytetään proteiinin eluointiin kolonnista. Jos käytetään tekijä Xa: ta, on suositeltavaa dialysoida proteiini joko Tris-tai PBS-puskuriksi ennen pilkkoutumista.; eluutiopuskurissa oleva glutationi voi häiritä hyytymistekijä Xa: ssa olevia disulfidisiltoja, mikä johtaa fuusioproteiinin tehottomaan pilkkoutumiseen. Pilottidigestiokokeessa on määritettävä kunkin fuusioproteiinin digestio-olosuhteet empiirisesti. Kätevä menetelmä on sulattaa 100 µg fuusioproteiinia eri entsyymi-substraatti-suhteilla ja muuttaa inkubaatioaikaa. Tyypilliset inkubaatioajat ovat 2-8 tuntia. trombiinin Suositeltavat entsyymi-substraattisuhteet ovat 1:100, 1:350, 1:1000, ja 1:3000 (entsyymiyksikköä / µg fuusioproteiinia) ja tekijä Xa: lle ovat 1:10, 1:25, 1:50, 1:100, 1:300 (µg entsyymiä / µg fuusioproteiinia). Halutuissa aikapisteissä poistetaan 2 µg proteiinia ja pysäytetään ruoansulatus lisäämällä näyte-erä kiehuvaan SDS-näytepuskuriin. Analysoi näytteet SDS-PAGE määrittää optimaalinen pilkkominen olosuhteissa. Entsyymi-substraatti-suhteen ja ajan lisäksi on harkittava puskuriolosuhteiden muuttamista, kuten NaCl-pitoisuuden lisäämistä tai pienentämistä tai Ca2+: n lisäämistä puskuriin (vianmääritysvihjeet, KS.Huomautus 31).

31 jos KOHDEPROTEIININ SDS-sivulla havaitaan useita vyöhykkeitä digestion jälkeen, tarkista kohdeproteiinisekvenssi mahdollisten sekundaaristen proteaasintunnistuskohtien varalta. Jos sekundaarisia pilkkomispaikkoja on olemassa, kloonataan uudelleen eri vektoriksi. Jos pilkkoutumista ei havaita, tarkistetaan DNA-sekvenssi, jotta voidaan varmistaa odotettavissa olevan proteaasin pilkkoutumiskohdan esiintyminen ja eheys. Varmista, että proteaasinestäjät ovat poistuneet puskurista kokonaan. Lisää entsyymiä ja / tai lisää inkubaatioaikaa yön yli. Jos digestio pysyy epätäydellisenä suurimmilla entsyymi-substraatti-suhteilla ja pisimmillä aikapisteillä, harkitse proteaasin pilkkoutumiskohdan uudelleenjärjestelyä siten, että siihen sisältyy useita glysiinejä GST-osan ja kohdeproteiinin välillä, jotta voidaan vähentää steerisen esteen todennäköisyyttä häiritä pilkkoutumista (19, 20).

32 jos entsyymin estyminen digestion jälkeen seriiniproteaasin estäjillä on epätoivottavaa, näyte voidaan levittää HiTrap-bentsamidiinikolonniin entsyymin poistamiseksi näytteestä.

33jos näyte on uudelleenkromatografioitava glutationisefaroosikolonnissa GST: n ja mahdollisen sulamattoman fuusioproteiinin poistamiseksi, on ratkaisevan tärkeää, että pelkistetty glutationi poistetaan kokonaan näytteestä. Glutationi tasapainottuu hyvin hitaasti dialyysikalvojen läpi; siksi jos käytetään dialyysiputkea, jonka MWCO on <12 000, puskurin täydellinen poistaminen voi edellyttää vähintään 3 puskurin muutosta. Myös dialyysiaika (yön yli) ja puskurivolyymi voivat olla tarpeen suurille näytemäärille.

34 samaa glutationisefaroosikolonnia voidaan käyttää sekä fuusioproteiinin alkuperäiseen eristämiseen että entsymaattisen pilkkoutumisen jälkeiseen repurisointiin. On suositeltavaa omistaa yksi kolonni yksittäiselle proteiinirakenteelle, jotta vältetään eri rekombinanttiproteiinien mahdollinen ristikontaminaatio. Pylväitä voidaan käyttää uudelleen useita kertoja. Jos sidontateho laskee ajan myötä, puhdista kolonni valmistajan suositusten mukaisesti. Jos sitovuutta Ei palauteta, on käytettävä uutta saraketta.

35maksimaalinen sitoutuminen tapahtuu, jos sarake on täysin pienentynyt; jos glutationisefaroosikolonni on kuitenkin pesty alle 48 tuntia ennen tätä vaihetta, tämä vaihe voidaan jättää väliin.

36 kohdeproteiini on sitoutumattomassa fraktiossa ja GST ja kaikki pilkkoutumaton fuusioproteiini sitoutuvat kolonniin.

37pieniä näytemääriä suositellaan kohdeproteiinin ja muiden vierasaineiden hyvän erotuskyvyn saavuttamiseksi. Jos näytettä ei voida konsentroida pieneen tilavuuteen, näytettä voidaan antaa useita injektioita.