PMC

CPV-2 on tärkein etiologinen agentti virusperäisen gastroenteriitti koirilla. Se kuuluu Parvovirusten (parvovirus) heimoon ja Protoparvoviruksen tyypin 1 lajeihin. Se on vaipaton virus, jolla on yksijuosteinen DNA-genomi, joka koodaa kahta kapsidiproteiinia, VP1: tä ja VP2: ta, joita tarvitaan viruksen genomin kokoamiseen ja pakkaamiseen, sekä NS1: tä ja NS2: ta rakenteettomia proteiineja, jotka auttavat DNA: n replikaation, kokoamisen ja geenien ilmentymisen säätelyn valvonnassa .

viimeisten vuosien aikana CPV-2 on kehittänyt uusia antigeenisiä variantteja. Vuonna 1980 CPV-2: n alkuperäinen kanta korvattiin muunnoksella tyyppi 2a (CPV-2a), vuonna 1984 CPV-2b tunnistettiin ja vuonna 2001 CPV-2C havaittiin ja raportoitiin Italiassa. Viimeinen muunnos on myös tunnistettu Aasiassa, Afrikassa ja Amerikassa. Koska CPV-2: lle on olemassa useita antigeenisiä variantteja, kliiniset oireet voivat vaihdella suuresti .Tämän jälkeen eläinlääkäreillä on vähemmän varmuutta, kun he antavat ennakko-diagnoosinsa, ja yleensä tarvitaan joitakin laboratoriokokeita diagnoosin vahvistamiseksi.; vaikka tutkimuslaboratorioissa on kehitetty useita tekniikoita, kuten hemagglutinaatiokokeet, immunofluoresenssi, ELISA,PCR, immunokromatografiatesti ja soluviljelmä (mm.), itse asiassa tekniikoita, joilla on suurin saatavuus kliinisten laboratorioiden sisällä eläinsairaalassasonly ovat immunokromatografiatesti ja PCR, kuitenkin näiden menettelyjen herkkyyttä ja spesifisyyttä koskevassa tutkimuksessa raportit ovat kiistanalaisia.Näiden tekniikoiden herkkyyttä ja spesifisyyttä ei ole myöskään tutkittu laajasti potilailla, joiden sairauden vaikeusaste vaihtelee.

tämän tutkimuksen tavoitteena on raportoida immunokromatografiatestin ja PCR: n tarjoamista eduista ja haitoista sellaisten potilaiden diagnosoinnissa, joilla esiintyy CPV-2: n kliinisten oireiden moninaisuutta.

tämä tutkimus tehtiin Experimental Animal Research Mexican Official Norm Nom-062-ZOO-1999: n ohjeiden mukaan.

Universidad Autónoma de Estado de Méxicon Pieneläinten eläinsairaalassa kliinistä enteriittiä sairastavat koirat seulottiin tätä tutkimusta varten, ja ne valittiin testatun positiivisen tai negatiivisen CPV-2: n perusteella käyttäen sisäkkäistä PCR: ää (NPCR). Tämän seurauksena valittiin 45 testattua koiraa, jotka testattiin positiivisiksi, ja 5 negatiivisiksi testattua koiraa otettiin mukaan kontrolleihin. Kolme eläinlääkäriä tutki 50 koiraa kliinisesti samanaikaisesti kliinisen diagnoosin herkkyyden saamiseksi. Jokainen veterinarian antoi hänen oletettu diagnoosi diskreetti tavalla, käyttäen ongelma oriented veterinary medical record (POVMR) niiden diagnostinen työkalu.

seuraavaksi kaikkien koirien ulostenäytteet analysoitiin PCR-ja immunokromatografiatestillä, kun taas verinäytteistä tehtiin täydellinen verenkuva.

nPCR: ää pidetään erittäin luotettavana ja herkkänä menetelmänä CPV-2-viruspartikkelien tunnistamiseksi , ja siksi tässä tutkimuksessa käytettyjen testien herkkyys korreloi aiemmin nPCR: stä saatuihin CPV-2-diagnostiikkaan.

Koiran ulostenäytteistä otettiin rektaalinäytteitä, jotka suspendoitiin nukleaasittomaan veteen ja 200 µl homogenaatteja, ja niitä käytettiin fordna-uuttona. Toimenpide tehtiin QIAamp® DNA-ulosteen DNA-uuttopakkauksella (QIAGEN, Mainz, Saksa) valmistajan ohjeiden mukaisesti. AllDNA-näytteet kvantifioitiin q5000 Quawell-spektrofotometrillä (Quawell Technology, Inc., San Jose, CA, Yhdysvallat). PCR-reaktioissa käytettiin 100 ng kunkin näytteen DNA: ta, jonka lopullinen tilavuus oli 50 µl. Aiemmin laboratoriossamme suunniteltiin pari aluketta vahvistamaan 275 bp: n fragmenttia, ParvoInt2FB (5′-TCAAGCAGGTGATCCAAG-3′) ja ParvoInt2CR (5′-GGTACATTAATTGCAGTTA-3′), jotka sijaitsevat VP2–geenin nukleotideissa 1,107–1,130 ja 1,360-1,382 (GenBankaccession-numero fj0051962c).

PCR-reaktioita suoritettiin käyttäen 2 µl kutakin primeria (200 nM), 12, 5 µl Gotaq® Green Master Mixiä (Promega, Madison,WI, U. S. A.), joka sisälsi DNA-polymeraasia, reaktiopuskuria (pH 8, 5) ja 400 µM kutakin nukleotidia (dATP, dGTP, Dctp ja dTTP); 3 mM MgCl2: ta.ja 28.5 µl nukleaasitonta vettä. Kaikki reaktiot suoritettiin seuraavissa vahvistusolosuhteissa: 1 jakso 94°C: n lämpötilassa 5 minuutin ajan ennen alkuperäistä denaturointia, sen jälkeen 35 jaksoa 94°C: n lämpötilassa 30 sekunnin ajan, 52°C: n lämpötilassa 1 minuutin ajan, 72°C: n lämpötilassa 1 minuutin ajan ja viimeinen jatkojakso 72°C: n lämpötilassa 5 minuutin ajan.

nPCR tehtiin alun perin vahvistamalla 1,740 bp: n fragmentti ParvoExt1f: N (5′-ATGAGTGAGCAGTTCA-3′) ja ParvoExt3R: N (5′-AGGTGCTGAGATTCATATAC-3′) alukkeilla,ja se suunniteltiin käyttämällä nukleotidisekvenssejä 1-20 ja 1,712–1,740 geenistä VP2 koiran parvovirukselle (genbank liittymisnumero fj0051962c). Reaktio vakioitiin lopulliseksi tilavuudeksi 50 µl.

reaktioseos sisälsi 1 µl Gotaq® Flexi-DNA-polymeraasia 5 U/µl (Promega), 5 µl gotaq® Flexi-puskuria 5XGreen, 3 µl MgCl2 25 mM, 4 µl dNTP: n 200 µM, 2 µl alukkeita, 10ΜL DNA: ta, jonka lopullinen pitoisuus on 100 ng ja 23 µl nukleaasitonta vettä. Reaktio suoritettiin seuraavissa vahvistusolosuhteissa: 1 sykli 94°C: ssa 5 minuutin ajan, sen jälkeen 35 sykliä 94°C: ssa 30 sekunnin ajan, 50°C 45 sekunnin ajan, 72°C: ssa 1 minuutin ajan ja 1 sykli 72°C: ssa 5 minuutin ajan. Tämän jälkeen 1 µl tämän reaktion tuotetta käytettiin DNA-mallina pesimätoimenpiteessä, ja alukkeet ja amplifikaatio-olosuhteet olivat samat 275 bp: n fragmentille.

kaikki vahvistustuotteet tunnistettiin horisontaalisella elektroforeesilla 2%: n agaroosigeeleistä, jotka värjättiin 0, 5 µg/ml ofetidiumbromidilla ja visualisoitiin UV-transilluminaattorilla.

anigen® kit (Bionote Inc., Gyeonggi-do, Korea) hyödynnettiin. Jokainen testi suoritettiin valmistajan ohjeiden mukaisesti.

verinäytteet otettiin kaulalaskimosta käyttäen vacutainer-putkia, joissa oli antikoagulanttina EDTA. Täydelliset VERENKUVAT (CBC) määritettiin anautomatoidulla solulaskurilla (QBC vet-IDEXX Laboratories, Inc., Westbrook, ME, Yhdysvallat). Verifilmit värjättiin Wright-Giemsalla ja tutkittiin fotonikroskoopilla. Leukopeniaa harkittiin, kun CBC: n kokonaismäärä oli alle 6 × 103/µl .

tulokset analysoitiin käyttämällä matriisia koodatuille muuttujille , ja diagnostisten testiominaisuuksien määrittämiseksi laadittiin ennakointitaulukot . Lisäksi Kappa-statistiikka määritettiin arvioimaan kolmen käytetyn testin ja nPCR: n välinen sopimus. Kanteren ja kollegoiden mukaan kappa-arvo määriteltiin vuonna 2015, jolloin kappa-arvo 1 kertoo absoluuttisesta sopimuksesta, kun taas arvo 0 kertoo, että sopimus tapahtuu sattuman vuoksi. Yleisesti ottaen Kappa-arvot, jotka ovat yli 0,6, osoittavat hyvän sopimustason; analyysi tehtiin käyttäen TILASTOPAKETTIA SPSS Ver. 22.0 (IBM, Inc., Armonk, NY, Yhdysvallat).

Ninety one point one (91,1) % NPCR: n CPV-2-positiivisista koirista oli puhdasrotuisia; 95.5% potilaista oli kahden-kahdeksan kuukauden ikäisiä ja 4, 5% oli vuoden ikäisiä. Rokotustilanteen osalta 40% rokotettiin vähintään kerran CPV-2-tartunnan estämiseksi.

näiden koirien kliinisten oireiden esiintymistiheys oli seuraava: 44, 4%: lla esiintyi oksentelua ja ripulia; 20%: lla oli kuumetta, oksentelua ja ripulia(katarraalisuus tai verenvuototauti); 17, 7%: lla oli vain ripulia; 8, 8%: lla näkyi vain oksentelua; 4, 4%: lla oli ripulia ja kuumetta ja 4, 4%: lla oksentelua ja kuumetta.Leukopeniaa todettiin 48, 8%: lla koirista (Taulukko 1).

kliinisessä tutkimuksessa eläinlääkärit diagnosoivat vain 57, 8% potilaista, jotka olivat positiivisia CPV-2: lle, ja 100% negatiivisista koirista; siksi kliinisen diagnoosin herkkyysarvoksi arvioitiin 57, 7% (CI0, 95 42, 2–72), ja havaittu spesifisyys oli 100% (CI0, 95 46, 2–98, 8).

laboratoriokokeiden diagnosoinnissa 100%: lla nPCR-positiivisista koirista vain 30/45 näistä potilaista oli CPV-2-positiivisiaimmunokromatografisella testillä, kun taas viidellä CPV-2-negatiivisella verrokkipotilaalla diagnoosi oli oikea. Siksi tämä tekniikka osoitti herkkyyden 66, 6% (CI0.95 50, 9–79, 5) ja havaittu spesifisyys oli 100% (CI0.95 46, 2–98, 8).

PCR-tekniikkaa käyttäen 36 / 45 potilasta oli positiivisia CPV-2: lle, ja viiden kontrollipotilaan tulokset olivat negatiivisia koko nPCR-tutkimuksessa. Siten PCR: n herkkyys oli 80% (CI0.95 63, 1–87, 7) ja spesifisyys 100% (CI0.95 67, 8–99, 1) (kuva. 1).

näiden kolmen tekniikan välinen yksimielisyys osoitetaan Kappa-arvolla (Taulukko 2).

CPV-2: n aiheuttamaa gastroenteriittiä pidetään yhtenä tärkeimmistä virustaudeista, jotka vaikuttavat koiriin. Vaikka kliiniset oireet koiran parvovirus infektio voi vaihdella, themost yhteisiä oireita raportoitu olivat: anoreksia, masennus, letargia ,kuume, limainen ja hemorraginen ripuli ja leukopenia ; subkliinisissä tapauksissa, jotkut näistä oireista voi tai ei voi olla läsnä .

kliinisissä tutkimuksissa havaittiin vaihtelua infektion kliinisissä ilmenemismuodoissa. Vain 20 prosentissa tutkituista koirista esiintyi tyypillisiä merkkejä, joita kirjallisuudessa on yleisesti kuvattu. Tämän taudin kliinistä vaihtelua on raportoitu aiemmin , ja jotkut kirjoittajat ovat käsitelleet mahdollisia syitä, kuten ikää, immuunitilannetta, altistumisreittiä, virusannosta, kantojen virulenssia ja samanaikaista infektiota muiden tarttuvien aineiden kanssa . Tämä vaikeuttaa CPV-2: n tarkan diagnoosin saamista, kun eläinlääkärit luottavat pelkästään kliiniseen tutkimukseensa. Siksi pelkästään tähän menettelyyn perustuvassa tutkimuksessamme 42,2 prosentilla koirista on väärä negatiivinen CPV-2-diagnoosi.Koirien terveystietojen kautta tässä tutkimuksessa havaitsimme, että eläinlääkärit sulkivat pois infektion mahdollisuuden ensisijaisesti siksi, että koirilla ei ollut kirjallisuudessa kuvattuja klassisia kliinisiä oireita, ne oli rokotettu CPV-2: ta vastaan ja/tai ne olivat aikuisia. Suurimmalla osalla tutkimuksemme koirista oli kuitenkin epätyypillisiä oireita. Siksi katsomme, että CPV-2: n subkliiniset tartunnat ovat yleisempiä, ja eläinlääkäreiden, joiden on päätettävä, käyttävätkö ne ylimääräisiä diagnostisia testejä, joilla on suuri herkkyys ja spesifisyys, olisi harkittava näitä havaintoja huolellisesti.

tässä tutkimuksessa 40% CVP-2-positiivisista potilaista oli aiemmin rokotettu. On hyvin tunnettua, että PCR-tekniikka on erittäin herkkä, ja siksi se havaitsee äskettäin rokotettujen potilaiden ulosteissa tokkuraisia viruspartikkeleita; tutkimukset osoittavat, että on mahdollista saada vääriä positiivisia tuloksia 3 .-10. päivän jälkirokotuksesta muunnetulla elävällä CPV-rokotteella. Näin ollen tutkimuksen suorittamista varten potilaat, joilla on ollut rokotushistoria edeltävien 15 päivän aikana, jätettiin tutkimuksen ulkopuolelle. Lisäksi CPV-2-positiivisten rokotettujen koirien näytteet sekvensoitiin,ja kaikissa tutkituissa tapauksissa tunnistettiin genovariantti CPV-2C (tiedot eivät näy), mikä viittaa siihen, että koirat olivat saaneet CPV-2C-tartunnan kenttätutkimuksissa, vaikka Meksikossa ei vielä ole saatavilla CPV-2cvaccine-rokotetta. Lisäksi Meksikossa Pedroza kollegoineen kertoi, että tartunnan saaneilla koirilla yleisin antigeeninen muunnos oli CPV-2C .

toisaalta monet eläinlääkärit pitävät CPV-2-diagnoosia tukevana tekijänä leukopeniaa. Havaitsimme kuitenkin, että vain 48.8%: lla (22 / 45) tutkituista koirista esiintyi leukopeniaa arvioinnin aikana, mikä on yhdenmukaista muiden raporttien kanssa, joiden mukaan noin 50%: lla koirista ei ollut hematologisia oireita arviointihetkellä . Siksi CBC on arvokas työkalu, joka voi antaa tietoa sairauden vakavuudesta, mikä viittaa ennusteeseen ja määrittää hoitovasteen. Leukopeniaa ei kuitenkaan tule pitää CPV-2: n diagnostisena välineenä,koska se ei anna näyttöä viruksen esiintymisestä.

CPV-2: n tartunnan lopulliseen vahvistamiseen käytetään erilaisia virustunnistustekniikoita, esimerkiksi immunokromatografiaan perustuvia pikatestejä käytetään laajalti kliinikoissa, koska toimenpide on helppo, nopea ja helposti saatavilla. Lisäksi se ei vaadi näytteen valmistelua tai lähettämistä erikoistuneeseen laboratorioon analysoitavaksi. Tämän testin vaihteleva herkkyys on sen haittapuolena; useat tutkimukset ovat osoittaneet , että sen herkkyys vaihtelee 50-100%: n välillä, ja tutkimuksessamme vertaileva herkkyys nPCR: llä oli 66,6%. Jotkut tutkimukset ovatväittäneet, että alhainen tekniikka herkkyys johtuu tarpeesta suuri virus hiukkasia määriä irtoa ulosteeseen koirien saada positivediagnoosi . Tämän tekniikan käyttöä on harkittava uudelleen, koska väärien negatiivisten tulosten todennäköisyyden odotetaan olevan suurempi. Tämän estämiseksi on käytettävä muita tekniikoita, joilla on suurempi herkkyys .

useat tutkimukset ovat osoittaneet PCR-pohjaisten testien suuren herkkyyden; tällä hetkellä samasta menetelmästä on useita variantteja, joiden herkkyysvaihtelut ovat 80-100% . Tässä tutkimuksessa PCR: n herkkyys oli 80%, ja on huomionarvoista mainita, että potilaat tunnistettiin positiivisiksi infektiolle vain NPCR: n avulla, kun taas PCR: ää tai immunokromatografiatestejä ei pystytty tunnistamaan.

kappa-arvon osalta vertasimme kolmen analysoidun menetelmän tuloksia nPCR: ään. Kliinisen diagnoosin ja NPCR: n välinen heikko yhteisymmärrys osoitettiin kuitenkin; tavanomaisen PCR: n ja nPCR: n välillä havaittiin Kohtalaista yhteisymmärrystä, mikä saattaa johtua näiden kahden testin samankaltaisuudesta.

kliinisten oireiden osalta kaikilla viraalisesti infektoituneilla potilailla havaittiin joko oksentelua tai ripulia, kun taas muiden kliinisten oireiden ei katsottu liittyvän infektioon. Esimerkiksi tapaus nro 26 osoitti vain oksentelua kliinisenä merkkinä, ja se katsottiin negatiiviseksi CPV-2: lle eläinlääkärin kliinisen diagnoosin perusteella, mutta immunokromatografiatesti, PCR ja npcrtestit olivat positiivisia CPV-2: lle. Lisäksi tapaukset 41 ja 42, joissa pääasiallinen kliininen oire oli ripuli, voitiin todeta positiivisiksi CPV-2: lle vain nPCR: n avulla.

tietojemme mukaan yleisimmin käytetyt diagnostiset testit kliinisissä ja diagnostisissa eläinlääketieteellisissä laboratorioissa CPV-2: n havaitsemiseksi ovat erittäin spesifisiä, mutta pakkasherkkyys estää CPV-2: n tarkan diagnosoinnin. Tutkimuksessamme PCR ja immunokromatografiatesti eivät olleet yhtä herkkiä kuin nPCR, mikä vahvistettiin aiemmissa tutkimuksissa , mutta NPCR: n käyttö diagnoositestinä ei ole vielä levinnyt laajalle eläinsairaaloissa, vaikka sitä käytetään edelleen laajalti tutkimustarkoituksiin.

sitä vastoin reaaliaikaista PCR: ää, joka on myös erittäin herkkä, käytetään harvoin sen korkeiden laitekustannusten ja sen käsittelyyn erikoistuneen henkilökunnan vuoksi. Teknologisen kehityksen ansiosta nämä tekniikat ovat kuitenkin tulleet halvemmiksi ja yksinkertaisemmiksi käyttää, mikä voi johtaa siihen, että niitä voidaan soveltaa suoraan eläinlääkintäsairaaloissa CPV-2: n diagnostisen tarkkuuden parantamiseksi.