Proteiinipuhdistusedit
Polyhistidiini-tageja käytetään usein Escherichia coli-bakteereissa ja muissa prokaryoottisissa ilmentymisjärjestelmissä ilmaistujen polyhistidiinimerkittyjen rekombinanttiproteiinien affiniteettipuhdistukseen. Bakteerisolut kerätään sentrifugoimalla ja syntyvä solupelletti lysytetään joko fysikaalisin keinoin tai pesuaineiden ja entsyymien, kuten lysotsyymin tai näiden yhdistelmän avulla. Tässä vaiheessa raaka lysaatti sisältää rekombinanttiproteiinia monien muiden bakteerien isännästä peräisin olevien proteiinien joukossa. Tätä seosta inkuboidaan affiniteettihartsilla, joka sisältää sidottuja kaksiarvoisia nikkeli-tai koboltti-ioneja, joita on kaupallisesti saatavilla eri lajikkeina. Nikkelillä ja koboltilla on samanlaiset ominaisuudet ja koska ne ovat vierekkäisiä periodi 4 siirtymämetalleja (v. rautakolmi). Nämä hartsit ovat yleensä sefaroosi / agaroosi funktionalisoitu kelataattorilla, kuten iminodietikkahappo (ni-IDA) ja nitrilotrietikkahappo (Ni-NTA) nikkelille ja karboksyylimetyyliaspartaatti (Co-CMA) koboltille, jonka polyhistidiini-tagi sitoutuu mikromolaarisella affiniteetilla. Ernst Hochuli ym. kytketty 1987 NTA ligand ja nikkeli-ionit agaroosihelmiin. Tämän jälkeen hartsi pestään fosfaattipuskurilla sellaisten proteiinien poistamiseksi, jotka eivät varsinaisesti ole vuorovaikutuksessa koboltti-tai nikkeli-ionin kanssa. Ni-pohjaisilla menetelmillä pesutehokkuutta voidaan parantaa lisäämällä siihen 20 mM imidatsolia (proteiinit eluoidaan yleensä 150-300 mM imidatsolilla). Yleensä nikkelipohjaisilla hartseilla on suurempi sidontakyky, kun taas kobolttipohjaisilla hartseilla on korkein puhtaus. Proteiinin puhtautta ja määrää voi arvioida SDS-PAGE-ja Western blotting-menetelmällä.
Affiniteettipuhdistus polyhistidiinitunnisteella johtaa yleensä suhteellisen puhtaaseen proteiiniin, kun rekombinanttiproteiini ilmaistaan prokaryoottisissa organismeissa. Riippuen tuotantoketjun loppupään sovelluksista, mukaan lukien proteiinikompleksien puhdistus proteiinien vuorovaikutusten tutkimiseksi, puhdistus korkeammista organismeista, kuten hiivoista tai muista eukaryooteista, voi vaatia tandem-affiniteettipuhdistusta käyttämällä kahta tunnistetta korkeamman puhtauden saavuttamiseksi. Vaihtoehtoisesti yksivaiheinen puhdistus immobilisoiduilla koboltti-ioneilla nikkeli-ionien sijaan tuottaa yleensä huomattavaa puhtauden kasvua ja vaatii alhaisempia imidatsolipitoisuuksia his-merkityn proteiinin eluutioksi.
Monihistidiini-merkintä on vaihtoehto rekombinanttiproteiinien puhdistamiseksi denaturointiolosuhteissa, koska sen vaikutustapa riippuu vain proteiinien primäärirakenteesta. Esimerkiksi, vaikka rekombinantti proteiini väkisin ilmaistuna E: ssä. coli tuottaa inkluusiorungon eikä sitä voida saada liukoisena proteiinina, se voidaan puhdistaa denaturoimalla urealla tai guanidiinihydrokloridilla. Yleensä tällaista tekniikkaa varten histidiinisidonta titrataan käyttämällä pH: ta imidatsolisidonnan sijaan—korkeassa pH: ssa histidiini sitoutuu nikkeliin tai kobolttiin, mutta alhaisessa pH: ssa (~6 koboltille ja ~4 nikkelille) histidiini protonoituu ja kilpailee metalli-ionista. Vertaa tätä vasta-aineiden puhdistukseen ja GST-puhdistukseen, jonka edellytyksenä on mukana olevien proteiinien oikea (natiivi) taitto. Toisaalta sanotaan, että His-tunniste pyrkii kokoamaan ja liukenemaan enemmän kuin muut affiniteettitunnisteet.
Polyhistidiini – tagikolonnit säilyttävät useita tunnettuja proteiineja epäpuhtauksina. Yksi niistä on fkbp-tyyppinen peptidyyliprolyyli-isomeraasi, joka esiintyy noin 25kda (SlyD). Epäpuhtaudet eliminoidaan yleensä sekundaarisella kromatografisella menetelmällä tai ilmaisemalla rekombinantti proteiini SlyD-puutteellisessa E. coli-kannassa. Vaihtoehtoisesti, vertaamalla nikkeli-pohjainen, koboltti-pohjainen hartseja on vähemmän affiniteetti Slyd E. coli, mutta useissa tapauksissa, se on kohtalaisen hyödyllistä.
proteiinit, joissa on eri määrä polyhistidiinitageja, eluoituvat eri tavalla kuin nikkeli-affiniteettihartsi. Proteiineille, joissa on yksi heksahistidiini-tagi, 75 mM imidatsoli mahdollistaa eluutiot Ni-NTA: sta, kun taas proteiineille, joissa on kaksi heksahistidiini-tagia, eluutioon tarvitaan 100 mM imidatsolia. Tätä vaiheittaista eluutiota voidaan käyttää tiettyjen proteiinikokoonpanojen eristämiseen seoksesta, kuten määritetyistä heteromultimeereista (esim.AB-heterodimeeri seoksesta, johon kuuluvat AA-ja BB-homodimeerit, jos vain alayksikössä B on polyhistidiinitunnus). Tällaista lähestymistapaa käytettiin monovalentin streptavidiinin eristämisessä.
Binding assaysEdit
Polyhistidiinimerkintää voidaan käyttää proteiinien ja proteiinien yhteisvaikutusten havaitsemiseen samalla tavalla kuin pull-down-määritystä. Kuitenkin, tämä tekniikka pidetään yleensä vähemmän herkkä, ja myös rajoittaa joitakin enemmän nirso näkökohtia tämän tekniikan. Esimerkiksi pelkistäviä olosuhteita ei voida käyttää, EDTA: ta ja monenlaisia pesuaineita ei voida käyttää. Kaksoispolarisaatiointerferometrian viimeaikaiset edistysaskeleet ovat otollisia EDTA: lle ja reagenssien laajemmalle käytölle, ja tällaisten paikkasidonnaisten tunnisteiden käyttö yksinkertaistaa huomattavasti siihen liittyvän konformaatiomuutoksen suoraa mittaamista.
fluoresoivia tageja
Heksahistadiinin Kydye-tageja on myös kehitetty. Nämä käyttävät nikkelin kovalenttista koordinaatiota fluoriforeihin kiinnittyneisiin EDTA-ryhmiin, jotta saadaan aikaan väriaineita, jotka kiinnittyvät polyhistidiinitunnisteeseen. Tämän tekniikan on osoitettu olevan tehokas proteiinin siirtymisen ja kaupan seuraamisessa. On myös viime löytöjä, jotka osoittavat, että tämä tekniikka voi olla tehokas, jotta voidaan mitata etäisyyden kautta fluoresoiva Resonanssienergian siirto.
polyfluorihistidiini tagia on raportoitu käytettäväksi in vitro-translaatiojärjestelmissä. Tässä järjestelmässä käytetään laajennettua geneettistä koodia, jossa histidiini korvataan 4-fluorohistidiinillä. Fluorattu analogi sisällytetään peptideihin histidiini-tRNA-ligaasin rennon substraattispesifisyyden kautta ja alentaa tagin yleistä pKa: ta. Tämä mahdollistaa polyfluorihistidiinillä merkittyjen peptidien valikoivan rikastamisen perinteisten polyhistidiinitunnisteiden monimutkaisten seosten läsnä ollessa muuttamalla pesupuskureiden pH: ta.
