TUNEL-määritystä käytetään yleisimmin apoptoosin eli ohjelmoidun solukuoleman läpikäyvien solujen havaitsemiseen. Apoptoosi on tärkeä biologinen prosessi kehityksen aikana ja kudosten homeostaasin ylläpitämiseksi. TUNEL-värjäys mahdollistaa apoptoottisten solujen visualisoinnin ja kvantifioinnin. Tämä auttaa tutkijoita testaamaan uusien hoitojen tehoa häiriöihin, joissa apoptoosi on joko estynyt, kuten syövässä, tai tehostunut, kuten neurodegeneraatiossa.
tässä videossa selitetään, miten TUNEL-määritystä voidaan käyttää apoptoosin läpikäyvien solujen merkitsemiseen, mikä on vaiheittainen protokolla tämän menetelmän suorittamiseksi kudososastoilla, ja miten tutkijat soveltavat tätä tekniikkaa solukuoleman mekanismien ymmärtämiseksi.
ennen TUNEL-määrityksen protokollaan tutustumista keskustellaan tämän tekniikan taustalla olevista periaatteista.
yksi apoptoosin monista tunnusmerkeistä on DNA: n pirstoutuminen. Miten DNA: n pirstoutuminen tapahtuu? Apoptoosin suorittavat entsyymit, joita kutsutaan kaspaaseiksi sytosolissa. Niiden ensisijainen tehtävä on pilkkoa proteiineja solun hajottamiseksi. Lisäksi kaspaasit aktivoivat kaspaasiaktivoitua dnaasia eli CAD-entsyymiä irrottamalla sen inhibiittoristaan ICAD: stä. Aktivoitu CAD on endonukleaasi, joka kulkee tumaan ja pilkkoo kromosomaalista DNA: ta.
DNA: n pilkkoutuminen aiheuttaa lopulta DNA-fragmenttien kertymistä, joissa on viilletyt päät, ja TUNEL-määritys osoittaa fluoresoivasti nämä sirpaloituneen DNA: n viilletyt päät, jolloin tutkijat voivat havaita apoptoosin. Mutta miten tämä tapahtuu? Sitä varten sinun on ymmärrettävä VIRITYSREAKTIO. TUNEL tulee sanoista terminal deoxynucleotidyl transferase-välitteinen dutp nick-end labeling. Kaksi tärkeintä TUNEL-reagenssia ovat terminaalinen deoksinukleotidyylitransferaasi eli TdT ja deoksiuridiinitrifosfaatti eli dUTP, joka voidaan merkitä fluoresenssilla havaitsemisen helpottamiseksi.
TUNEL-reaktion ymmärtämiseksi palataan apoptoottisiin soluihin DNA-fragmenttien kanssa. Näissä nirhautuneissa fragmenteissa on vapaita 3′ hydroksyyliryhmiä. Kun TUNEL-reagenssit lisätään apoptoottisia soluja sisältävään näytteeseen, fluoresenssilla merkityt dutp: t kiinnittyvät näihin 3′ hydroksyyliryhmiin katalyyttisen entsyymin TDT: n avulla. Tällä menetelmällä värjättyjä soluja kutsutaan TUNEL-positiivisiksi soluiksi, jotka voidaan sitten visualisoida fluoresenssimikroskopian avulla.
nyt kun ymmärrät TUNEL-määrityksen perusperiaatteet ja käsitteet, hahmotellaan yleinen protokolla tämän tekniikan suorittamiseksi kudososastoilla. TUNEL-määrityksen tärkeimmät vaiheet ovat kiinnostavan kudoksen kiinnittäminen, kudoksen läpäisevyys, TUNEL-reagenssien lisääminen, TUNEL-reaktion pysäyttäminen ja lopuksi analyysi.
ensin on kiinnitettävä kiinnostava kudos biologisten rakenteiden säilyttämiseksi. Kiinnittyminen toimii ristisitoutumalla proteiineihin solujen sisällä. TUNEL-määritystä varten kudokset voidaan kiinnittää lisäämällä ne 4% paraformaldehydiä sisältävään liuokseen 4-24 tunnin ajan 4°C: ssa.kiinnittämisen jälkeen kudos kryosektioidaan ohuiksi viipaleiksi, joiden koko on enintään 10 µm.
seuraava vaihe on permeabilisaatio, jolloin reagenssit, kuten TdT-entsyymi, pääsevät tunkeutumaan solun tumaan. Kudososien permeabilisaatio voidaan suorittaa lisäämällä kudos proteinaasi K-liuokseen 5-15 minuutiksi 37°C: ssa.kudososat huuhdellaan fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella orbitaalirakettilaitteessa 15-30 minuutin ajan huoneenlämmössä.
permeabilisaation jälkeen kudososioihin lisätään TDT-entsyymi ja fluoresoivasti merkityt dutpit sekä merkintäpuskuri, joka sisältää kobolttia, joka toimii TUNEL-reaktion kofaktorina. Yhdessä TUNEL-reaktioseosta ja kudososaa inkuboidaan 1-3 tuntia 37°C: n lämpötilassa ja suojataan valolta fluoresenssin haalistumisen estämiseksi.
inkubaation jälkeen kudososaan lisätään stop-puskuri TUNEL-reaktion lopettamiseksi, ja lyhyen inkubaation jälkeen osat pestään fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella. Lopuksi kudososat värjätään fluoresenssilla merkityillä dUTP: llä visualisoidaan fluoresenssimikroskopialla ja arvioidaan TUNEL-positiivisten solujen lokalisointia tietyssä kudoksessa. Solukuolema voidaan määrittää yksinkertaisesti laskemalla TUNEL-positiivisten solujen prosenttiosuus tietyssä kudososassa.
nyt kun olet nähnyt, miten TUNEL-määritys suoritetaan apoptoottisten solujen havaitsemiseksi, keskustellaan siitä, miten tätä määritystä voidaan käyttää solubiologien esittämiin kysymyksiin.
solukuolema tapahtuu normaalina osana kudosten ja rakenteiden muokkausta sekä tarpeettomien solujen eliminointia. Tästä ilmiöstä kiinnostuneet tutkijat tutkivatkin sikiöaltistuksen vaikutusta eri aineille apoptoosiin kehityksen aikana. Täällä tutkijoita kiinnosti tutkia raskaudenaikaisen alkoholialtistuksen vaikutusta aivojen kehitykseen. Sikiön aivoille tehdyn TUNEL-värjäyksen tulokset paljastivat lisääntyneen apoptoosin kudoksissa, jotka olivat ennen syntymää altistuneet alkoholille, verrattuna verrokkieläimiin.
tutkijat käyttävät TUNEL-määritystä myös apoptoosin tutkimiseen bakteeri-infektion yhteydessä. Tässä kokeessa tutkijat kehittivät mallin keuhkokuumeeseen ruiskuttamalla hiirille Pseudomonas aeruginosa-bakteeria, joka aiheuttaa keuhkotulehdusta. Sitten, keuhkokudos poistettiin ja TUNEL värjäys tehtiin tutkia apoptoosi vastauksena bakteeri-infektio. Tulokset osoittavat, että bakteereille altistuneilla hiirillä apoptoottinen solukuolema lisääntyi verrattuna verrokkieläimiin.
lopuksi, TUNEL-värjäystä voidaan käyttää ihmisen kasvainnäytteissä, jotta voidaan määrittää kasvaimen reagointikyky lääkkeille. Tässä esimerkissä kasvainnäytteet otettiin ihmispotilailta ja viljeltiin ex vivo. Seuraavaksi heitä hoidettiin prekliinisillä lääkkeillä ja vaste arvioitiin TUNEL-määrityksellä. Saadut tiedot osoittavat, että hoito lääkkeellä, joka estää lämpöshokkiproteiini 90 lisää merkittävästi apoptoosia kasvainkudoksessa.
olet juuri katsonut joven videon TUNEL-määrityksen käyttämisestä apoptoosin läpikäyvien solujen tunnistamiseen. Tämä video tarkasteli periaatteita TUNEL värjäys, ja askel-askeleelta protokolla suorittaa TUNEL määritys kudoksen osia. Tarkastelimme myös, miten tätä menetelmää voitaisiin soveltaa ohjelmoidun solukuoleman ymmärtämiseen kehityksen ja sairauksien aikana. Kuten aina, Kiitos katselusta!
