tähän tehtävään osallistui Kurt Thorn Nikon Imaging Centeristä UCSF: stä.
elävien solujen kuvantamiskokeissa yleinen vaatimus on kyky seurata samanaikaisesti useita fluoresenssilla merkittyjä lajeja. Fluoresoivien proteiinien merkitseminen edellyttää useita fluoresoivia proteiineja, joiden magnetointi-ja emissiospektrit eroavat toisistaan niin paljon, että ne voidaan kuvata erillisinä fluoresoivina kanavina mikroskoopilla. Fluoresoivien proteiinien yleistyessä viime vuosina on monia fluoresoivia proteiiniyhdistelmiä, joita voidaan kuvata yhteen, mutta tämä tarkoittaa myös sitä, että fluoresoivien proteiinien valinta vaatii jonkin verran miettimistä.
ensimmäinen askel valittaessa fluoresoivia proteiineja monivärikuvauskokeeseen on olla tietoinen siitä, mitä fluoresoivia proteiineja on saatavilla. Kun uusia fluoresoivia proteiineja julkaistaan joka kuukausi, parhaan proteiinin valitseminen tiettyyn sovellukseen on haastavaa. Jotta pysyisit ajan tasalla uusimmista fluoresoivista proteiineista, pidän yllä interaktiivista graafia ja taulukkoa parhaista tällä hetkellä saatavilla olevista fluoresoivista proteiineista.
yhteensopivien fluoresoivien proteiinien valitseminen
jotta voidaan valita joukko fluoresoivia proteiineja, on otettava huomioon samat tekijät kuin yksittäisen fluoresoivan proteiinin valinnassa (kirkkaus, fotostabiilisuus ja niin edelleen; katso edellisestä blogikirjoituksesta lisätietoa näistä tekijöistä). Lisäksi sinun on myös valittava fluoresoivia proteiineja, jotka voidaan erottaa toisistaan ja jotka voidaan kuvata mikroskoopilla(s), jota aiot käyttää. Tarkka määritys siitä, voidaanko kaksi fluoresoivaa proteiinia erottaa toisistaan, edellyttää niiden eksitaatio-ja emissiospektrien tuntemusta, mutta hyvä nyrkkisääntö on, että sekä näiden kahden proteiinin huippuviritysaallonpituudet että emissioaallonpituus on erotettava toisistaan 50-60 nm: llä. Esimerkiksi CFP (ex 430 nm / em 474 nm) ja YFP (ex 514 nm / em 527 nm) voidaan kuvata yhdessä, mutta CFP ja GFP (ex 488 nm / em 507 nm) osoittavat jonkin verran ylikuulumista kahden fluoresoivan proteiinin välillä. Jos sinun täytyy kuva fluoresoiva proteiineja, joiden spektrit päällekkäisiä, on olemassa tekniikoita, kuten spektrinen unmixing, jota voidaan käyttää erottamaan fluoresoiva proteiineja, mutta nämä ovat soveltamisalan ulkopuolella tämän post.
ovatko fluoresoivat proteiinisi yhteensopivia mikroskoopin optiikan kanssa?
selvittääksesi, ovatko kiinnostuksesi kohteena olevat fluoresoivat proteiinit yhteensopivia mikroskoopin optiikan kanssa, sinun kannattaa verrata proteiinisi heräte-ja emissiospektriä mikroskoopin suodatinsarjoihin tai lasereihin. Ihanteellista olisi, että eksitaatio-ja emissiosuodattimet sekä proteiinin eksitaatio-ja emissiospektrit olisivat huomattavasti päällekkäisiä, jotta mikroskoopilla saadaan proteiini hyvin viritettyä ja mikroskoopilla saadaan tehokkaasti kerättyä proteiinin fluoresenssiemissiot. Verratakseen fluoresoivan proteiinin ja suodatinsarjan vastaavuutta monet suodatinsarjat tarjoavat työkaluja proteiinien ja väriaineiden fluoresenssispektrien ja niiden suodattimien (KS.Chroman, Semrockin tai Omegan) kuvaamiseen. Vaikka nämä eivät sisällä kaikkia yleisessä käytössä olevia fluoresoivia proteiineja (etenkään Viimeksi julkaistuja), ne voivat olla hyvä lähtökohta. Monesti riittää, että käyttää spektriä läheistä sukua olevalle proteiinille, jos tietää, että kiinnostavalla proteiinilla on samanlainen spektri. Esimerkiksi tässä on kuvakaappaus Chroma Spectra Viewer vertaamalla standardi Cy3 tai Rhodamine suodatin joukko (Chroma #49004) spektri sekä mCherry ja TagRFP.
tässä TagRFP-spektri näkyy tummemmilla väreillä ja mcherryn spektri vaaleammilla väreillä; eksitaatiospektrit ovat sinisiä ja emissiospektrit punaisia. Kumpikaan ei vastaa täydellisesti suodatinsarjaa, mutta herätesuodatin herättää enemmän tagrfp-heräteen huippua ja päästösuodatin kerää suuremman osan TagRFP-päästöstä kuin mCherry-päästö. Tämän suodatinsarjan osalta odotamme TagRFP: n antavan kirkkaamman signaalin kuin mCherry. Yleensä rhodamiinille / Cy3 suunnitellut suodatinsarjat toimivat paremmin lyhyemmän aallonpituuden punaisilla fluoresoivilla proteiineilla, kuten TagRFP: llä tai mRuby2: lla kuin pidemmän aallonpituuden proteiineilla, kuten mcherryllä. Fluoresenssi-ja suodatinsarjojen taustat löytyvät ibiologian Fluoresenssimikroskopian luennosta.
yleisesti käytetyt suodatinsarjat & relevantit fluoresoivat proteiinit
yleisesti käytetyt suodatinsarjat monivärikuvauksessa ovat sellaiset, jotka on suunniteltu CFP: lle, YFP: lle ja RFP: lle tai Sedat-Quad-suodatinsarjat, jotka on suunniteltu Dapi: lle / Fluoreseiinille / Rhodamiinille / Cy5: lle (esim. Semrock: t) ja samanlainen 4-laseryhdistelmä konfokaalissa (405 / 488 / 561 / 640 nm). Käsissämme parhaat fluoresoivat proteiinit kuvantamiseen tällä sarjalla ovat mTagBFP2, EGFP tai yksi parannelluista GFP-muunnoksista, mRuby2 tai TagRFP-T, ja infrapuna-fluoresoiva proteiini, kuten iFP1.4 tai iFP2.0. Varo, että nämä infrapuna fluoresoivat proteiinit vaativat biliverdin kofactor ja niin saatat joutua täydentää soluja biliverdin maksimaalisen kirkkauden. Nisäkässoluissa yksi EGFP: n parannelluista taitettavista muunnoksista, kuten mEmerald tai Clover, lienee paras; mNeonGreen on vielä uudempi vihreä fluoresoiva proteiini, jonka oletetaan olevan erittäin kirkas. S. cerevisiae, olemme testanneet useita vihreitä ja punaisia fluoresoivia proteiineja tällä suodatinsarjalla ja raportoineet kirkkausmittauksista. Tässä EGFP päihittää parannetut taittovariantit, oletettavasti alhaisemman kasvulämpötilan vuoksi. Tämä viittaa kuitenkin myös siihen, ettei ole olemassa yhtä fluoresoivaa proteiinia, joka olisi optimaalinen kaikille eliöille, ja että jos haluat kirkkaimman signaalin, sinun on ehkä kokeiltava useita proteiineja kiinnostavassa järjestelmässäsi. Lopuksi, tässä valkuaisainesarjassa vihreät ja punaiset proteiinit ovat yleensä kaikkein havaittavimpia, joten niitä tulisi käyttää merkitsemään vähiten runsaita valkuaisaineita, ja sinisiä ja infrapunakanavia käytetään runsaampiin proteiineihin tai merkintälokeroihin.
toivon, että tämä valaisee monivärikuvausta fluoresoivilla proteiineilla. Oikean mikroskoopin ja loisteproteiinien oikean valinnan avulla neljän värin kuvaamisen samanaikaisesti pitäisi olla melko yksinkertaista.
Kiitos vierailevalle bloggaajalle!
Kurt Thorn on apulaisprofessori UCSF: ssä, jossa hän johtaa Nikonin Kuvantamiskeskusta. Hän väitteli biofysiikan tohtoriksi UCSF: stä Ronald Valen laboratoriossa, minkä jälkeen hän oli stipendiaattina Harvardin yliopiston Bauer Center for Genomics Research-instituutissa. Lue lisää laboratorion sivuilta tai mikroskopia-blogista.
