Multi-color coloração com corantes fluorescentes é usado ativamente para observar a distribuição de materiais biológicos (tais como proteínas, lipídios, ácidos nucléicos e íons) no campo de tecidos e células de investigação. A tecnologia de detecção para observação de fluorescência avançou para um nível no qual uma única molécula de corante fluorescente pode ser detectada nas melhores circunstâncias. Esta seção analisa vários dos aspectos importantes da microscopia de imagem de fluorescência ao longo da vida (FLIM), uma nova tecnologia de microscopia de fluorescência. Além da coloração multi-cores, a imagem de vida de fluorescência também pode ser utilizada para visualizar os fatores que afetam as propriedades de vida de fluorescência da molécula de cor, ou seja, o estado do ambiente em torno da molécula. Espectroscopia de fluorescência convencional utiliza as propriedades de cor dos corantes fluorescentes, ou seja, a identificação é baseada em diferenças nas características espectrais de fluorescência entre os corantes. Com esta técnica, cinco ou seis corantes na faixa de comprimento de onda de ultra violeta a infravermelho próximo podem ser usados simultaneamente sob microscopia, sem confusão entre cores.
espectroscopia ao longo da vida
cada corante fluorescente tem a sua própria vida no estado excitado. Ao detectar diferenças na vida útil, é possível distinguir até mesmo corantes com a mesma cor fluorescente, bem como identificar autofluorescência. Além disso, as imagens sinal-ruído elevado podem ser obtidas utilizando uma sonda com uma vida útil muito longa em comparação com a dos corantes fluorescentes normalmente utilizados. Por exemplo, a coproporfirina platina tem uma vida útil de milissegundos, enquanto as vidas de corantes fluorescentes normais são de nanossegundos. Tais corantes fluorescentes de vida relativamente longa serão usados em breve como sondas para detecção de ADN em chips.
a imagem ao longo da vida de fluorescência também permite obter informações sobre as moléculas ao observar uma célula viva. Os fatores que afetam o tempo de vida da fluorescência incluem intensidade iônica, propriedades hidrofóbicas, concentração de oxigênio, ligação molecular e interação molecular por transferência de energia quando duas proteínas se aproximam umas das outras. A vida útil é, no entanto, independente da concentração de Corante, fotobleaching, dispersão de luz e intensidade de luz de excitação. Assim, a imagem de fluorescência ao longo da vida permite-nos realizar uma medição precisa da concentração de iões e uma análise de transferência de energia por ressonância de fluorescência (FRET).
existem dois métodos de imagiologia por fluorescência ao longo da vida: o método do domínio do tempo e o método do domínio da frequência.
- FLIM do domínio do Tempo-em alguns casos de atraso após excitação por um laser pulsante, a imagem de fluorescência pode ser obtida pelo funcionamento da porta do Intensificador de imagem. O tempo de vida é medido em nanossegundos por um laser com uma duração de pulso de algumas centenas de picosegundos e um obturador de nível de nanossegundos, porque o tempo de vida de um estado de excitação é geralmente de 1 a 20 nanosegundos. A high-speed gate image intensifier is commercially available from Hamamatsu Photonics K. (Hamamatsu, Japan). A vida útil de fluorescência em cada pixel também pode ser obtida através da medição, variando o tempo de atraso até que um portal se abra. Imagens de fluorescência ao longo da vida são mostradas em pseudocolor de acordo com suas vidas.O tempo de vida de FLIM-fluorescência do domínio de frequência é calculado medindo a mudança de fase da fluorescência e a redução da sua amplitude utilizando um detector com um modulador de ganho, quando o laser utilizado como fonte de luz de excitação é modulado (1 a 200 megahertz). A medição pode ser efectuada por varrimento laser (fotomultiplicador) ou por meio de um dispositivo de carga acoplada (CCD).
aplicações
o ambiente que rodeia a sonda é detectado com base no facto de o tempo de vida de fluorescência ser sensível às concentrações de iões de hidrogénio (pH), oxigénio e iões de cálcio. A ligação ou a interação entre moléculas também pode ser medida em combinação com FRET.
concentração de Iões De Cálcio Imagiologia
quando o ião cálcio se liga a uma sonda fluorescente como Fura-2, Fluo-3 ou Calcium Green, tanto o tempo de vida de fluorescência como a intensidade de fluorescência mudam. O procedimento convencional de medição da concentração de iões centra-se na mudança de intensidade. De acordo com a alteração da concentração do ião cálcio, a razão de corantes entre os iões de cálcio ligados e não ligados, o que leva subsequentemente a uma alteração na vida útil de fluorescência do ponto de medição no provete. Para além da sonda de iões de cálcio, esta técnica é também aplicável à medição do pH e de outros iões, como o ião de sódio e o ião de magnésio.
Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET)
Research is currently being conducted on FRET by green fluorescent protein (GFP) variants (GFP with a different fluorescence color). FRET torna possível medir as interações (associação ou dissociação) entre duas proteínas que são rotuladas com um par de corantes fluorescentes. Um corante fluorescente doador tem comprimentos de onda de excitação/emissão mais curtos que fornecem energia para um corante de fluorescência aceitante. O tempo de vida do Estado de excitação do corante Dador é variável dependendo se o aceitador (o corante que recebe a energia) existe ou não. A medição baseada no tempo de vida permite uma melhor quantificação, uma vez que não é necessário considerar a sobreposição da fluorescência durante a detecção.
imagem clínica
como alguns tecidos e espécimes citodiagnósticos têm forte autofluorescência, o uso de sondas com longas vidas (até milisegundos) foi tentado. Sondas de longa duração também são úteis na hibridização por fluorescência in situ (FISH) porque o número de cores que podem ser usadas simultaneamente é limitado com esta técnica. A concentração de íons de hidrogênio no sangue, bem como as pressões de oxigênio e dióxido de carbono, já foram medidos com base no tempo de vida de fluorescência, embora tais medições ainda não sejam possíveis sob microscopia.
recursos da Internet
- Center for Fluorescence Spectroscopy-hospedado pelo Professor Joseph R. Lakowicz na Universidade de Maryland, este site é um excelente recurso para informações sobre imagens de vida de fluorescência e outros aspectos da espectroscopia de fluorescência e microscopia.
- Kentech Instruments-Kentech fabrica geradores de impulsos de estado sólido de alta voltagem e sistemas ópticos de imagem gravados para imagens ao longo da vida de fluorescência.
- Hamamatsu Photonics-além de sua excelente formação de sistemas de câmera digitais, Hamamatsu também fabrica fotomultipliers, fotodiodos de avalanche, e intensificadores de imagem de portão de alta velocidade.
- PRS BioSciences-especializando-se em microscopia biológica de fluorescência, PRS BioSciences fabrica um sistema de tempo livre que pode ser adaptado a muitos microscópios de pesquisa.
