G418

G418 (Geneticin, Invitrogen): dissolver em água a 200 mg/ml, esterilizar filtros e armazenar em alíquotas a 4 °C.

clonNAT (nourseothricin, Werner BioAgents, Jena, Alemanha): dissolver em água a 100 mg/ml, esterilizar filtros e armazenar em alíquotas a 4 °C.

canavanina (sal de sulfato de l-canavanina, Sigma, C-9758): dissolver em água a 100 mg/ml, esterilizar filtrantes e Conservar em alíquotas a 4 °C.

tialisina (cloridrato de s-(2-aminoetil)-l-cisteína, Sigma, a-2636): Dissolve in water at 100 mg/ml, filter sterilize, and store in aliquots at 4 °C.

Amino acids supplement powder mixture for synthetic media (complete): Contains 3 g adenine (Sigma), 2 g uracil (ICN), 2 g inositol, 0.2 g para-aminobenzoic acid (Acros Organics), 2 g alanine, 2 g arginine, 2 g asparagine, 2 g aspartic acid, 2 g cysteine, 2 g glutamic acid, 2 g glutamine, 2 g glycine, 2 g histidine, 2 g isoleucine, 10 g leucine, 2 g lysine, 2 g methionine, 2 g phenylalanine, 2 g proline, 2 g serine, 2 g threonine, 2 g tryptophan, 2 g tyrosine, and 2 g valine (Fisher). Drop-out (DO) Mistura de pó é uma combinação dos ingredientes acima, menos o suplemento apropriado. São utilizadas duas gramas da mistura DO pó por litro de meio.

suplemento de Aminoácidos para a esporulação médio: Contém 2 g de histidina, 10 g de leucina, 2 g de lisina, 2 g uracilo; 0,1 g de suplementos de aminoácidos mistura de pó é usado por litro de esporulação médio.

Glucose (Dextrose, Fisher): preparar uma solução a 40%, autoclave e conservar à temperatura ambiente.

YEPD: Adicionar 120 mg de adenina (Sigma), 10 g de extracto de levedura, 20 g de peptona, 20 g de ágar BTO (BD Difco) a 950 ml de água num balão de 2 l. Após autoclave, adicionar 50 ml de solução de glucose a 40%, misturar cuidadosamente, arrefecer a ~ 65 °C e verter placas.

YEPD + G418: meio Yepd fresco a ~ 65 ° C, adicionar 1 ml de solução-mãe G418 (concentração final de 200 mg/l), misturar cuidadosamente e verter placas.

YEPD + clonNAT: meio Yepd fresco a ~ 65 ° C, adicionar 1 ml de solução-mãe de clonNAT (concentração final 100 mg/l), misturar cuidadosamente e verter placas.

YEPD + G418/clonNAT: Meio de YEPD fresco a ~ 65 ° C, adicionar 1 ml de G418 (concentração final 200 mg/l) e 1 ml de soluções-mãe de clonNAT (concentração final 100 mg/l), misturar cuidadosamente e verter placas.Esporulação enriquecida

: adicionar 10 g de acetato de potássio( Fisher), 1 g de extracto de levedura, 0,5 g de glucose, 0,1 g de mistura de aminoácidos em pó para esporulação, 20 g de ágar bacto a 1 l de água num balão de 2 l. Após autoclave, meio fresco a ~ 65 °C, adicionar 250 µl de solução-mãe G418 (concentração final 50 mg/l), misturar cuidadosamente e verter placas.

(SD/MSG) − Seu/Arg/Lys + canavanine/thialysine/G418: Adicionar 1,7 g de fermento de nitrogênio base de w/s de aminoácidos ou sulfato de amônia (BD Difco), 1 g de ERRO (l-ácido glutâmico sal de sódio aquoso, Sigma), 2 g de aminoácidos que complementam a mistura do pó (DO − Seu/Arg/Lys), 100 ml de água 250 ml frasco. Adicionar 20 g de ágar bacto a 850 ml de água num balão de 2 l. Autoclave separadamente. Combinar autoclavados soluções, adicionar 50 ml de 40% de glicose, legal médio ~ 65 °C, adicionar 0,5 ml de canavanine (50 mg/l), 0,5 ml de thialysine (50 mg/l), e 1 ml G418 (200 mg/l) soluções estoque, misture bem e despeje placas. Sulfato de amônio impede a função de G418 e clonNAT. Por conseguinte, o meio sintético que contém estes antibióticos é produzido com ácido glutâmico monossódico como fonte de azoto (Cheng et al., 2000).

(SD/MSG) − seu/Arg/Lys + canavanina/tialisina/clonNAT: adicionar 1,7 g de base azotada de levedura (m/o), aminoácidos ou sulfato de amónio, 1 g de MSG, 2 g de mistura em pó de aminoácidos (DO − His/Arg/Lys), 100 ml de água num balão de 250 ml. Adicionar 20 g de ágar bacto a 850 ml de água num balão de 2 l. Autoclave separadamente. Combinar soluções autoclavadas, adicionar 50 ml de glucose a 40%, Meio fresco a ~ 65 °C, Adicionar 0.5 ml de solução-mãe canavanina (50 mg/l), 0, 5 ml de tialisina (50 mg/l) e 1 ml de solução-mãe de clonNAT (100 mg/l), misturar cuidadosamente e verter placas.

(SD/MSG) − Seu/Arg/Lys + canavanine/thialysine/G418/clonNAT: Adicionar 1,7 g de fermento de nitrogênio base de w/s de aminoácidos ou sulfato de amônia, 1 g de ERRO, de 2 g de aminoácidos que complementam a mistura do pó (DO − Seu/Arg/Lys), 100 ml de água 250 ml frasco. Adicionar 20 g de ágar bacto a 850 ml de água num balão de 2 l. Autoclave separadamente. Combinar soluções autoclavadas, adicionar 50 ml de glucose a 40%, Meio fresco a ~ 65 °C, Adicionar 0, 5 ml de canavanina (50 mg/l), 0.Solução-mãe de 5 ml de tialisina (50 mg/l), 1 ml de G418 (200 mg/l) e 1 ml de clonNAT (100 mg/l), misturar cuidadosamente e verter placas.

(SD/MSG) completo: adicionar 1, 7 g de base azotada de levedura, m / o, aminoácidos ou sulfato de amónio, 1 g de MSG, 2 g de mistura de pós de aminoácidos (completo), 100 ml de água num balão de 250 ml. Adicionar 20 g de ágar bacto a 850 ml de água num balão de 2 l. Autoclave separadamente. Combinar soluções autoclavadas, adicionar 50 ml de glucose a 40%, misturar cuidadosamente, meio fresco a ~ 65 °C e verter placas.

SD-His / Arg / Lys + canavanina/ tialisina: Add 6.7 g de base azotada de levedura (m/o) de aminoácidos( BD Difco), 2 g de mistura de aminoácidos em pó (do − His/Arg/Lys), 100 ml de água num balão de 250 ml. Adicionar 20 g de ágar bacto a 850 ml de água num balão de 2 l. Autoclave separadamente. Combinar soluções autoclavadas, adicionar 50 ml de glucose a 40%, Meio fresco a ~ 65 ° C, Adicionar 0, 5 ml de canavanina (50 mg/l) e 0, 5 ml de solução-mãe de tialisina (50 mg/l), misturar cuidadosamente e verter placas. Este meio não contém antibióticos como o G418 ou o clonNAT e, portanto, o sulfato de amónio é utilizado como fonte de azoto.

SD-Leu/Arg/Lys + canavanina/tialisina: adicionar 6,7 g de base azotada de levedura, m/o aminoácidos, 2 g de mistura de aminoácidos em pó (do − Leu/Arg / Lys), 100 ml de água num balão de 250 ml. Adicionar 20 g de ágar bacto a 850 ml de água num balão de 2 l. Autoclave separadamente. Combinar soluções autoclavadas, adicionar 50 ml de glucose a 40%, Meio fresco a ~ 65 ° C, Adicionar 0, 5 ml de canavanina (50 mg/l) e 0, 5 ml de solução-mãe de tialisina (50 mg/l), misturar cuidadosamente e verter placas.