Advances in Genomic Testing-Quello che c’è da sapere

Advances in Genomic Testing-Quello che c’è da sapere

da Dr. C. H. Weaver MD aggiornato 9/1/2018

D: Che cosa è il test genomico?

A: Il test genomico esamina un gruppo di geni e i loro diversi livelli di espressione. Questa espressione genica o attività può caratterizzare come i geni interagiscono tra loro e prevedere il comportamento di alcuni tessuti all’interno del corpo. Questo è in contrasto con il test genetico, che esamina un cambiamento specifico all’interno di un singolo cromosoma o gene, spesso come parte di un tratto ereditario.

D: Che ruolo gioca il test genomico nella diagnosi del cancro?
A: I test genomici possono fornire informazioni sulla prognosi di un paziente in base all’espressione genica all’interno del tessuto tumorale di un individuo e possono spesso prevedere se una certa terapia (come la chemioterapia) sarà di beneficio.

D: A che punto del processo diagnostico si verifica il test genomico?
A: Il test genomico può avvenire in qualsiasi momento dopo l’acquisizione di un campione di tessuto (biopsia o resezione) del cancro.

D. Quali domande devo fare al mio team sanitario sui test genomici?
A: Le seguenti sono le domande principali da porre al proprio operatore sanitario.

• Sono disponibili test genomici per il tipo di cancro che ho, per aiutare a determinare la mia prognosi complessiva?
• I risultati di questo test hanno il potenziale per cambiare la gestione del cancro? Specificamente:
  • Il test sarà in grado di dirmi se alcune terapie saranno di beneficio nel mio trattamento?
• Hai avuto risultati positivi nell’utilizzo di questo test con altri pazienti?
• Questo test è coperto dal mio piano assicurativo? (Questo tipo di test può essere eseguito in migliaia di dollari, anche se molti piani coprono i test senza una spesa out-of-pocket.)

D: Esistono tipi di cancro specifici per i quali il ruolo dei test genomici è particolarmente significativo?

A: Esistono tre tipi di pazienti oncologici per i quali i test genomici possono essere particolarmente vantaggiosi:

• I pazienti con cancro al seno positivo al recettore degli estrogeni che non si è ancora diffuso ai linfonodi (cancro al seno in fase iniziale) possono avere una prognosi difficile da prevedere con la sola biopsia tissutale. I test genomici possono non solo aiutare a fornire informazioni prognostiche (cioè la sopravvivenza prevista a 10 anni), ma possono anche prevedere se la chemioterapia sarà di qualche beneficio significativo, consentendo al paziente di evitare la tossicità della chemioterapia quando possibile.
• I pazienti con alcuni tipi di cancro del colon possono anche beneficiare dei test genomici in termini di determinazione della prognosi, previsione dei benefici della chemioterapia e selezione della chemioterapia (determinazione degli agenti chimici che saranno di maggior beneficio).
• I pazienti con un tumore che si è diffuso in altri siti del corpo (malattia metastatica) o che si è ripresentato localmente (nonostante l’intervento chirurgico e/o la chemioterapia) possono essere sottoposti a test genomici che esaminano l’espressione in un’ampia varietà di geni, compresi quelli non tipicamente associati al sito originale del cancro. Questo tipo di test genomici in grado di identificare alcuni geni che possono potenzialmente essere un bersaglio per la terapia che inizialmente non è stato considerato. Una modifica a una terapia mirata avrebbe il potenziale per migliorare notevolmente la sopravvivenza.

Il ruolo emergente della genomica nella diagnosi e nel monitoraggio del cancro

Panoramica

Il cancro è il risultato di anomalie genetiche che influenzano la funzione di particolari geni. I geni determinano la forma, la funzione e i modelli di crescita delle cellule. Quelli che accelerano o sopprimono la crescita sono spesso coinvolti nel cancro. Ad esempio, molti tumori hanno un’anomalia in un gene responsabile della stimolazione della crescita cellulare e/o il gene che normalmente previene il cancro non funziona correttamente. Entrambe queste anomalie genetiche possono provocare una crescita cellulare incontrollata ed eccessiva, il tratto distintivo del cancro. I test genomici, o saggi come vengono chiamati dagli scienziati, sono uno strumento per identificare i geni specifici in un cancro che sono anormali o non funzionano correttamente. In sostanza, questo è come identificare la firma genetica o l’impronta digitale di un particolare cancro.

Il test genomico è diverso dal test genetico. I test genetici sono tipicamente utilizzati per determinare se un individuo sano ha un tratto ereditario (gene) che li predispone allo sviluppo del cancro. I test genomici valutano i geni in un campione di tessuto malato da un paziente a cui è già stato diagnosticato un cancro. In questo modo, i geni che hanno mutato, o hanno sviluppato funzioni anormali, vengono identificati in aggiunta a quelli che potrebbero essere stati ereditati.

I test genomici possono aiutare i medici a:

• Determinare una prognosi del paziente (risultato potenziale)
• Determinare se un tumore è aggressivo/a crescita rapida o lenta crescita
• Scegliere il trattamento più efficace per ogni individuo il cancro
• Monitorare i pazienti che sono sottoposti a trattamento per determinare se il trattamento sta funzionando
• Monitorare i pazienti che sono in remissione per la cattura di un potenziale di progressione della malattia iniziale, quando è più curabile

Forse la più grande promessa del test genomico è il suo potenziale per l’individualizzazione del trattamento. Ciò significa che i pazienti con condizioni più gravi possono essere identificati e offerti terapie aggressive e innovative che possono prolungare la loro vita, mentre i pazienti a cui viene diagnosticata una condizione meno grave possono essere risparmiati trattamenti non necessari. Ad esempio, alcune donne con cancro al seno negativo al nodo ricadono dopo essere state trattate con un solo intervento chirurgico. I test genomici hanno dimostrato di distinguere tra quali pazienti con tumore al seno negativo al nodo hanno maggiori probabilità di recidiva e quindi beneficiano di chemioterapia aggiuntiva e quali pazienti potrebbero non aver bisogno di chemioterapia.

Per apprezzare come la scienza della genetica viene applicata alla diagnosi e al monitoraggio del cancro, è utile avere una comprensione dei principi di base della genetica. Ciò include sapere quali DNA, cromosomi e geni sono, come funzionano e come le informazioni contenute nel DNA vengono trasformate, attraverso l’espressione genica, in strutture specifiche che dettano le funzioni di una cellula.

Con questa conoscenza di base, è possibile comprendere la promessa di test per rilevare anomalie genetiche, come ad esempio:

• ibridazione in situ in Fluorescenza (FISH)
• reazione a catena della Polimerasi (PCR)
• trascrizione Inversa PCR
• tecnologia di Microarray
• Siero di proteomica

Sfondo—Principi di Base della Genetica

L’importanza della genetica in eredità è ben noto; tuttavia, il ruolo che la genetica gioca nel controllo della struttura e funzione di cellule possono essere ancora più critica per un singolo organismo. Ereditarietà assicura che gli esseri umani e tutte le specie sono in grado di riprodurre e perpetuare i loro tratti unici e dirigere come le cellule sono costruite, quale lavoro fanno, e come crescono è necessario per garantire che un organismo sopravviverà a riprodursi. Una comprensione di questo ruolo critico che il DNA e i geni hanno nel determinare la vita minuto per minuto di una cellula è anche importante per capire come la genetica è coinvolta nel cancro.

DNA: L’informazione genetica di un intero organismo è contenuta nel nucleo di ogni cellula sotto forma di acido desossiribonucleico, comunemente noto come DNA. Il DNA è una molecola elicoidale a doppio filamento (arrotolata). Ogni filo è composto da una spina dorsale strutturale più una sequenza di composti contenenti azoto chiamati basi azotate, che può essere pensato come l’alfabeto della genetica. Ci sono quattro basi: adenina, guanina, timina e citosina. I due fili sono collegati alle basi.

Il codice genetico, o l’informazione genetica che controlla la struttura e la funzione della cellula, è contenuto nella sequenza di basi. La sequenza di base alla fine controlla la sequenza di aminoacidi che sono collegati tra loro per formare una molecola proteica. Diverse sequenze producono proteine diverse. Le proteine sintetizzate in una cellula determinano la struttura e la funzione di quella cellula.

Cromosomi: il DNA è confezionato in un numero specifico di unità chiamate cromosomi. Gli esseri umani hanno 46 cromosomi in ogni cellula. La maggior parte del tempo, i cromosomi sono imballati strettamente intorno alle proteine nel nucleo della cellula in modo che non possano essere visti. Tuttavia, nelle fasi della vita della cellula poco prima della divisione cellulare, i cromosomi diventano visibili con un microscopio ottico. Appaiono come una ” H ” maiuscola con quattro lunghezze di DNA arrotolato unite da una proteina come “croce” della “H”.

Geni: il DNA è organizzato in geni, che sono lunghi segmenti di DNA che includono regioni che contengono codici per proteine chiamate esoni, così come regioni non codificanti chiamate introni. I geni sono definiti come l’unità di base dell’ereditarietà perché vengono trasmessi alla prole e quindi replicati e trasmessi alle singole cellule durante la divisione cellulare. La replicazione comporta l’utilizzo di entrambi i filamenti di DNA come modelli per sintetizzare il DNA complementare (cDNA), che è un filamento corrispondente. Il risultato è due copie identiche di DNA per ogni cellula dopo che la divisione cellulare è completa. In condizioni normali, la struttura del DNA, e quindi dei geni, rimane relativamente costante attraverso la replicazione e la divisione cellulare.

Espressione genica: le informazioni genetiche contenute nei geni vengono tradotte in struttura e funzione cellulare attraverso un processo chiamato espressione genica. I geni possono essere pensati come codici, o ricette, per la produzione di proteine. Le proteine sono il componente di base della struttura e della funzione cellulare. Quando un gene viene “espresso”, la proteina o le proteine per cui codifica vengono attivamente costruite nella cellula e la funzione che queste proteine servono viene eseguita. Ad esempio, quando il gene HER-2/neu è espresso nel cancro al seno, ci sono più recettori del fattore di crescita epidermico (EGFRs) presenti, che sono proteine sulla superficie cellulare per cui HER-2/neu codifica. Inoltre, la funzione dell’EGFR è quella di stimolare la crescita cellulare; quindi una cellula che esprime HER-2 / neu ha molti EGFR e sta crescendo attivamente.

L’espressione genica avviene attraverso un sistema complesso che comporta i seguenti passaggi:

• Separazione temporanea dei due filamenti della molecola di DNA in un particolare gene.
• Trascrizione del segmento di DNA, che è la sintesi di una copia a filamento singolo della sequenza di DNA che viene esposta; questa copia è chiamata RNA messaggero (mRNA).
• Sintesi proteica, o la costruzione di nuove proteine nella cellula, sulla base delle informazioni contenute nel mRNA.

Anomalie genetiche: Le anomalie genetiche sono alterazioni nel DNA di una cellula che possono verificarsi per caso o a causa di un’influenza ambientale. Queste alterazioni prestano la cellula colpita qualche vantaggio rispetto alle cellule normali che li aiuta a crescere. Di conseguenza, la cellula è in grado di dividersi rapidamente, diventando una crescita del cancro. Tuttavia, questo vantaggio di crescita avvantaggia solo la singola cellula e non necessariamente l’intero organismo (umano).

I tipi di anomalie genetiche includono:

Traslocazioni-i luoghi mutevoli di un gene da un cromosoma con un gene su un altro cromosoma; questo tipo di anomalia definisce le diverse leucemie

Delezioni-un gene o una sequenza di nucleotidi manca nel DNA

Polimorfismi-variazioni nella sequenza nucleotidica

Test per rilevare anomalie genetiche

Una varietà di nuovi test di laboratorio in grado di rilevare anomalie genetiche. Trovare una mutazione che causa la malattia in un gene può confermare una diagnosi sospetta di cancro o identificare quelli predisposti a determinati tumori. Alcune di queste tecniche che sono attualmente utilizzate nell’ambito clinico includono:

• Ibridazione in situ a fluorescenza (FISH)
• Reazione a catena della polimerasi (PCR)
• PCR a trascrizione inversa

Inoltre, le seguenti tecniche di laboratorio vengono utilizzate nella ricerca sul cancro e potrebbero essere disponibili per l’uso clinico in futuro:

• Microarray

Ibridazione in situ a fluorescenza (FISH)

FISH è una tecnica di laboratorio utilizzata per rilevare anomalie genetiche a livello di singola cellula e singolo gene, come anomalie numeriche (guadagni e perdite di nucleotidi) e traslocazioni (i luoghi mutevoli di un gene o segmento di geni su un cromosoma con gene o un segmento su un altro cromosoma). Queste anomalie svolgono un ruolo nello sviluppo e nella progressione di alcuni tumori, come leucemie e linfomas1.

Come funziona il PESCE? Il PESCE viene eseguito su cellule campione il cui DNA si è svelato in modo che i singoli cromosomi siano visibili. Questo accade durante le fasi cellulari appena prima della divisione cellulare, chiamata metafase o interfase. Il DNA del campione viene prima denaturato usando il calore e la formammide chimica in modo che i singoli filamenti si separino, esponendo la sequenza di base. Successivamente, specifiche sequenze di DNA, chiamate sonde, che sono attaccate a fluoros colorati vengono incubate o combinate con il DNA del campione. Le sonde si ibridano (si connettono) con il DNA nei cromosomi che è il complimento alla sequenza di base nella sonda. La presenza o l’assenza di fluorescenza dal DNA ibridato e dalla sonda sono visibili con un microscopio specializzato e indicano se la sequenza di DNA di interesse è presente nel campione. Inoltre, tecniche di PESCE specializzate possono essere utilizzate per rilevare traslocazioni, inversioni e amplificazioni coinvolte nel cancro.2

PESCE nel carcinoma mammario e ovarico: un uso comune se il PESCE è quello di determinare se i pazienti con carcinoma mammario e ovarico sovraesprimono l’oncogene HER2/neu, un gene comunemente coinvolto nel cancro. HER2 / neu porta il codice genetico per il recettore HER2, una proteina sulla superficie di alcune cellule tumorali. HER2 si lega con i fattori di crescita nel sangue, stimolando così le cellule tumorali a crescere.

HER2 / neu è amplificato in circa il 20% al 30% dei tumori mammari e ovarici e questa amplificazione e/o sovraespressione indica una prognosi infausta.3 FISH può essere usato per osservare se l’oncogene HER2 / neu sta inviando segnali multipli a livello delle singole cellule, il che indica l’amplificazione del gene.

PESCI nei tumori ematologici (del sangue) : Il PESCE può anche essere usato per diagnosticare e gestire varie neoplasie ematologiche. L’anomalia genetica che è alla base di molte neoplasie ematologiche è la traslocazione cromosomica, o i luoghi mutevoli del gene da un cromosoma con un gene su un altro cromosoma.

Reazione a catena della polimerasi (PCR)

La PCR è un metodo di laboratorio in vitro che è utile per i test genetici per la malattia e per la rilevazione di una malattia residua minima, che è una piccola quantità di malattia rimasta dopo il trattamento che può portare a recidiva e in genere non è rilevabile con altre tecniche. Questa procedura amplifica un segmento di DNA da un piccolo campione, rendendolo rilevabile. Con la PCR, sequenze relativamente piccole di DNA noto possono essere replicate in milioni di copie in un breve periodo di tempo.

Come funziona la PCR? Questo metodo richiede quattro componenti principali: 1) il DNA del campione, 2) un ampio apporto di nucleotidi, 3) un enzima polimerasi termostabile che è responsabile della copia del DNA e 4) primer, breve sequenza di nucleotidi che si trovano su entrambi i lati del frammento di DNA di interesse e segnalano la polimerasi per iniziare la replicazione del segmento di DNA specifico.

La PCR è un processo in tre fasi, ognuna delle quali si verifica a una temperatura diversa. Il DNA del campione viene prima riscaldato a circa 90ºC per separare i 2 filamenti di DNA accoppiati. Una volta separato, viene raffreddato ad una temperatura che consente ai primer di ibridarsi alla loro sequenza complementare sul DNA bersaglio, circa 40ºC. Infine, la replicazione del DNA avviene a circa 70ºC, la temperatura alla quale la DNA polimerasi è più attiva. Questo processo viene ripetuto da 20 a 30 volte, con conseguente amplificazione di circa 1 milione di volte del frammento di DNA di interesse.4

Reverse transcription PCR

Reverse transcription (RT) – PCR è una tecnica che rileva il grado in cui i geni sono espressi. I processi complicati controllano quale segmento di DNA separa, viene trascritto (copiato) in mRNA e quindi espresso come proteine nella cellula. Non tutti i geni sono trascritti e poi espressi allo stesso modo. A causa di molti controlli nella cellula, alcuni geni sono sovra-espressi, il che significa che sono trascritti ed espressi ad un tasso superiore al normale, mentre altri geni sono ora espressi, o “disattivati” in modo che alcune funzioni non si manifestino nella cellula.

Come funziona RT-PCR? RT-PCR utilizza gli stessi passaggi della PCR per amplificare un segmento di DNA, ma il campione è una copia gratuita di mRNA. Iniziando con l’mRNA, questo test misura solo il DNA che viene espresso, rendendo possibile determinare il grado in cui determinati geni sono espressi. Gli usi recenti di RT-PCR nell’oncologia clinica comprendono la rilevazione delle micrometastasi del linfonodo nel cancro alla prostata e delle metastasi ossee nel cancro al seno.5

RT-PCR nel cancro al seno: Il breast cancer test Oncotype DX™ utilizza RT-PCR per determinare il rischio individuale di recidiva nelle donne con tumore al seno positivo al recettore degli estrogeni (ER) negativo al nodo. Questo test valuta l’espressione di 21 geni nel cancro al seno. La sovraespressione di alcuni di questi geni indica una prognosi peggiore, mentre l’espressione di altri può indicare una prognosi migliore. L’espressione di tutti i geni 21 viene utilizzata per calcolare un ” Punteggio di ricorrenza™”, o la probabilità che quel cancro si ripresenti. Un ampio studio clinico ha dimostrato che Recurrence Score™ era più efficace per predire la prognosi delle donne con cancro al seno negativo al nodo, ER-positivo rispetto alle misure standard come l’età del paziente, la dimensione del cancro e lo stadio del cancro.6

Strategie per migliorare il rilevamento di anomalie genetiche

Diversi metodi per rilevare anomalie genetiche vengono utilizzati per la ricerca sul cancro. Mentre non sono ancora abitualmente utilizzati in ambito clinico, i seguenti sembrano essere promettenti e possono essere utilizzati in futuro per diagnosticare, testare e monitorare il cancro.

Microarray: l’analisi Microarray è una tecnica che combina la biologia con l’informatica per generare un profilo genetico per un dato campione di tessuto che riflette l’attività di migliaia di geni. Questa tecnologia ha vantaggi rispetto FISH o PCR perché, in una singola analisi, può valutare l’espressione di tutti i geni che possono essere coinvolti in un cancro, piuttosto che solo alcuni. Mostrando graficamente come tutti i geni sono coinvolti in un cancro, i microarray possono generare una “firma genetica” per un particolare cancro. Ciò rende più precisa l’identificazione del sottotipo di cancro. La capacità di scattare un’istantanea della firma genetica di un cancro può portare a una migliore comprensione di come si sviluppa quel cancro e di come progettare un trattamento individualizzato.

Come funzionano i microarray? Mentre diversi metodi microarray sono utilizzati, ciascuno è costituito da cinque passaggi di base:

• Preparazione del campione
• Combinazione del campione con il chip del computer
• Scansione del chip del computer
• Normalizzazione
• Analisi del computer dei risultati.

Preparazione del campione: Nella fase iniziale, il cDNA viene sintetizzato dall’RNA mediante trascrizione inversa (ricorda che la trascrizione comporta la copia del DNA per produrre RNA, quindi la trascrizione inversa sta generando DNA dall’RNA) dall’RNA che è stato estratto sia da un test che da un campione di riferimento. I segmenti di DNA del campione sono etichettati con fluorocromi, o sostanze chimiche radioattive, in modo che possano essere rilevati dopo che si combinano con il chip del computer.

Combinazione del campione con il chip del computer: successivamente, il campione viene combinato con il chip del computer, che è una griglia rettangolare di punti. Ogni punto ha molte copie di una particolare sequenza di DNA. Queste sequenze sono derivate da database pubblici di sequenze di DNA che sono stati generati attraverso il progetto Genoma umano, lo sforzo scientifico che ha identificato praticamente tutte le sequenze di DNA nella specie umana.

Quando il campione viene aggiunto al chip del computer, si verifica un processo chiamato ibridazione. Ciò significa che il segmento di DNA del campione si lega (ibridizza) al segmento sul chip del computer che ha l’esatta sequenza complementare di nucleotidi (i quattro composti che sono l’alfabeto della genetica).

Scansione del chip del computer :una volta completata l’ibridazione, gli scanner vengono utilizzati per rilevare la fluorescenza e creare un’immagine digitale che riflette dove il DNA del campione combinato con macchie sul chip microarray.

Normalizzazione: Poiché le intensità del segnale grezzo possono variare tra i singoli chip di molti pazienti o esperimenti, l’intensità del singolo chip deve essere regolata su uno standard comune o normalizzata. Ad esempio, la sottrazione del rumore di fondo è un metodo di normalizzazione comune applicato a tutti i campioni. La normalizzazione consente di confrontare i profili di espressione genica di molti pazienti o esperimenti.

Analisi del computer: il passo finale in un esperimento di microarray è l’analisi del computer. Le migliaia di punti di dati grezzi risultanti dalle analisi microarray sono essenzialmente incomprensibili a meno che non siano valutati nel contesto di altri risultati. Ad esempio, il profilo di espressione genica (risultati microarray) del tessuto normale e malato può essere confrontato per identificare i geni che variano nella loro espressione e anche identificare un modello (profilo) che può indicare una classe distinta o stadio della malattia.7

Microarray in oncologia: L’analisi di Microarray ha contribuito all’oncologia aumentando la comprensione delle basi genetiche di diversi tipi di cancro, tra cui il linfoma non-Hodgkin a cellule B (BCNHL), la leucemia acuta e il cancro al seno.

• La conoscenza considerevole per quanto riguarda la patologia di BCNHL è stata acquisita confrontando i modelli di espressione genica del tessuto malato e normale. Due diverse categorie di malattie mostrano profili di espressione genica distinti. I microarray hanno contribuito a stabilire questi profili di espressione e, in futuro, potrebbero aiutare a classificare con precisione nuovi casi di BCNHL.
• Nel caso della leucemia acuta, i microarray hanno contribuito a stabilire modelli di espressione genica distinti che hanno contribuito a differenziare la leucemia linfocitica acuta (ALL) e la leucemia mieloide acuta (AML). Utilizzando questi profili, 29 dei 34 nuovi casi di leucemia sono stati correttamente previsti.
• Inoltre, i microarray hanno contribuito a identificare due distinti profili di espressione genica nel cancro al seno, BCRA1 e BCRA2. Questa scoperta suggerisce diversi modi in cui il cancro al seno si sviluppa e fornisce indizi che promuovono un’ulteriore comprensione della causa del cancro al seno.7

1 Spagnolo SD, Ellis DW, Juneja S, Leong AS, et al. Il ruolo degli studi molecolari nella diagnosi del linfoma: una revisione. Patologia 2004; 36 (1) 19-44.

2 Spurbeck JL, Adams SA, Stupca PJ, Dewald GW. Primer sulla genomica medica Parte XI: Visualizzazione dei cromosomi umani. Mayo Clinic Proceedings 2004: 79: 58-75.

3 Paik S, Hazan R, Fisher ER, et al. Risultati patologici dal national surgical adiuvant breast and bowel project: significato prognostico della sovraespressione della proteina erb B-2 nel cancro al seno primario. J Clin Oncol 1990; 8: 103-112.

4 Tefferi A, Wieben ED, Dewald GW, et al. Primer on Medical Genomics Parte II: Principi di base e metodi in Genetica molecolare. Mayo Clinic Proceedings 2002;77:785-808.

5 Tefferi A, Wieben ED, Dewald GW, et al. Primer on Medical Genomics Parte II: Principi di base e metodi in Genetica molecolare. Mayo Clinic Proceedings 2002;77:785-808.

6 Paik S, Shak S, Tang G, et al. Analisi multi-genica PT-PCR per la previsione delle recidive in pazienti con tumore al seno negativo al nodo-Studi NSABP B-20 e B-14. Proc del 26 ° annuale San Antonio Breast Cancer Symposium. Dicembre 3-8k, 2003; San Antonio, TX, Abstract #16.

7 Tefferi A, Bolander ME, Ansell SM, et al. Primer sulla genomica medica Parte III: Esperimenti di Microarray e analisi dei dati. Mayo Clinic Procedimenti2002;77: 927-940.