Confronto tra decalcificazione convenzionale e metodo a microonde nel tessuto osseo affetto da micetoma

Abstract

Il micetoma è una malattia granulomatosa permanente dei tessuti sottocutanei e delle ossa. L’istopatologia è un metodo indicativo comprovato basato sull’assunzione di una diagnosi definitiva di micetoma. Richiede un’elaborazione efficiente dei tessuti, compresa la decalcificazione ossea. Il processo di decalcificazione deve garantire la completa rimozione del calcio e anche una corretta conservazione della capacità di colorazione dei tessuti e dei microrganismi. Obiettivo. Per confrontare il metodo convenzionale utilizzato nella decalcificazione con il metodo a microonde utilizzando diverse soluzioni di decalcificazione. Sono state testate diverse caratteristiche, tra cui la velocità di decalcificazione e la conservazione morfologica e fungina nel tessuto osseo affetto da micetoma. Materiali e metodi. Sono state impiegate tre soluzioni di decalcificazione per rimuovere il calcio da 50 campioni di tessuto osseo affetti da micetoma, incluso il 10% di EDTA tamponato neutro (pH 7,4), il 5% di acido nitrico e il 5% di acido cloridrico. Sono stati utilizzati metodi convenzionali e microonde. La macchia di ematossilina-eosina (HE), la macchia di Gridley e la macchia di esammina-argento di Grocott sono state impiegate per valutare le morfologie dell’osso e dei funghi. Risultato. Il tempo di decalcificazione del metodo convenzionale rispetto al metodo a microonde con EDTA al 10% (pH 7,4) ha richiesto 120 ore e 29 ore, mentre l’acido cloridrico al 5% e l’acido nitrico al 5% hanno richiesto 8 ore e 3 ore, separatamente. Inoltre, il 10% di EDTA è il miglior agente decalcificante per la colorazione e le macchie fungine. l’acido cloridrico al 5% e l’acido nitrico al 5% possono essere utilizzati per la colorazione fungina. Conclusione. L’attuale studio ha studiato gli effetti di diversi agenti decalcificanti e due procedure di decalcificazione sulla conservazione della struttura ossea e sulla colorazione fungina, che aiuteranno a sviluppare protocolli adatti per le analisi del tessuto osseo affetto da infezione da micetoma.

1. Introduzione

Il micetoma è una malattia epidemica granulomatosa per tutta la vita, gradualmente deleteria della pelle e dei tessuti sottocutanei che può progredire verso strutture più profonde come muscoli e ossa e portare a un’ampia distruzione, principalmente dei piedi, che richiede ampie escisioni chirurgiche locali o amputazione degli arti . Il micetoma è definito dal triumvirato di espansione, seni estenuanti e esistenza di grani coloniali negli essudati infiammatori . L’infezione è classificata come eumicetoma (infezione fungina) o actinomicetoma (infezione batterica) . È ampiamente una condizione delle regioni tropicali e semitropiche, notevolmente il Sudan . I grani del raccolto di Madurella mycetomatis sono enormi, variando da 0,5 a 3 millimetri e appaiono arrotondati, ovali, o trilobati. Sono costituiti da cr incrociate radicate nel cemento marrone interstiziale, costituito da pigmento nero-marrone simile alla melanina . L’istopatologia è un metodo indicativo veloce e un processo vantaggioso sull’ipotesi di una diagnosi definitiva della malattia del micetoma e include una relazione che descrive la presentazione morfologica degli agenti causali. L’agente causale potrebbe ancora essere isolato dal tessuto osseo coinvolto . La decalcificazione è un passaggio fondamentale che viene comunemente raggiunto per l’esame istopatologico delle ossa . I minerali nelle ossa sono costituiti da calcio e fosforo e i sali insolubili comprendono oltre il sessanta per cento del tessuto osseo . Questi minerali forniscono la durezza dell’osso e sono la causa delle difficoltà durante il taglio del tessuto facendo uso dei microtomi rotatori . Tali tessuti devono essere trattati per estrarre il fosfato di calcio con una procedura nota come decalcificazione, rendendo il tessuto sufficientemente delicato da essere tagliato dal microtomo. La decalcificazione viene eseguita da acidi che formano sali di calcio solubili o agenti chelanti che si legano agli ioni di calcio. Gli attuali metodi convenzionali di decalcificazione sono caratterizzati da processi laboriosi e dal persistente fallimento della reazione di colorazione dei tessuti . Nel metodo convenzionale di decalcificazione, i tessuti ossei vengono posti in un fluido decalcificante a temperatura ambiente con variazioni della soluzione a intervalli regolari fino al raggiungimento del punto finale. La decalcificazione a microonde è una tecnica innovativa rispetto al metodo convenzionale . In questo processo, i tessuti solidi sono disposti nella soluzione decalcificante in un forno a microonde per le durate periodiche con gli spostamenti usuali dei liquidi decalcificanti fino al punto finale è raggiunto. La radiazione a microonde è stata condotta per accelerare la procedura di decalcificazione approssimativamente da giorni a ore . Lo scopo del presente studio era di confrontare il metodo convenzionale utilizzato nella decalcificazione con il metodo a microonde modificato utilizzando diverse soluzioni di decalcificazione. Sono state testate diverse caratteristiche, tra cui la velocità di decalcificazione e la conservazione morfologica e fungina nel tessuto osseo affetto da infezione da Madurella mycetomatis.

2. Materiali e metodi

Questo è uno studio descrittivo sperimentale volto a confrontare la procedura di decalcificazione convenzionale con la decalcificazione potenziata a microonde rispetto alla morfologia dei tessuti affetti da infezione da micetoma utilizzando ematossilina ed eosina, Gridley e Grocott hexamine-silver stains per l’identificazione completa degli organismi causali Madurella mycetomatis. Questo studio è stato condotto presso il Centro di ricerca Mycetoma nell’Ospedale universitario di Soba e la Facoltà di Scienze mediche di laboratorio, Università di Al Neelain. Il consenso informato scritto è stato ottenuto da tutti i pazienti. Sono stati raccolti cinquanta arti amputati affetti da micetoma. Le biopsie ossee sono state tagliate usando una sega adatta in pezzi di 5 mm di spessore e poi fissate in soluzione salina formale al 10% per 48 ore. Sono stati lavati sotto l’acqua corrente del rubinetto per 30 minuti per rimuovere il fissativo.

2.1. Procedura convenzionale di decalcificazione

Tre pezzi di sezioni di biopsie ossee spesse 5 mm sono stati immersi in tre becher Pyrex Tozzi da 250 ml contenenti ciascuno 100 ml di acido cloridrico acquoso al 5% (HCl), acido nitrico acquoso al 5% (HNO3) e acido etilendiamminotetraacetico al 10% (EDTA) posti a temperatura ambiente (media 28°C), vedere Tabella 1. Il punto finale della decalcificazione è stato controllato con il metodo dell’ossalato di calcio per i due decalcificanti acidi (5% HNO3 e 5% HCl) dopo un intervallo di due ore come segue: 5 ml del liquido decalcificante usato sono stati prelevati e posti in una provetta, quindi è stata aggiunta la cartina di tornasole e l’idrossido di ammoniaca è stato aggiunto goccia a goccia fino a quando la cartina di tornasole è cambiata, indicando che il liquido decalcificante del pH alcalino era chiaro. 5 ml di soluzione di ossalato di ammonio saturo sono stati aggiunti quando la soluzione decalcificante è diventata torbida, indicando la presenza di calcio nel tessuto osseo in modo che la soluzione decalcificante è stata sostituita con una nuova soluzione e il processo è stato ripetuto ogni 30 minuti fino al completamento del processo di decalcificazione. Per l’EDTA, sono stati utilizzati test fisici decalcificanti in cui il processo di decalcificazione è stato considerato terminato quando l’osso è stato facilmente penetrato da un ago. I tempi totali decalcificati medi erano 7 ore e 30 minuti, 8 ore e 120 ore per acido nitrico al 5%, HCl al 5% e EDTA al 10%, rispettivamente.

2.2. Procedura del forno a microonde

È stato utilizzato un forno a microonde domestico (Midea Microwave 20L, 700W, Digital, EM720CFF) con una piastra rotante immobile. Un bicchiere di vetro contenente 100 ml di acqua distillata è stato preriscaldato per 5 secondi per riscaldare il magnetron. Questo è stato sostituito da 100 ml di acqua distillata fresca e irradiato per mantenere la temperatura a circa 41-43°C. Ciò ha richiesto 15 secondi. Il bicchiere di vetro è stato allocato in vari punti del forno mentre lo si irradia per risolvere la migliore posizione del campione durante la decalcificazione a microonde poiché il forno a microonde utilizzato aveva una tempistica costante ma non una temperatura costante. Tre pezzi di sezioni di biopsie ossee dello spessore di 5 mm sono stati immersi in becher Pyrex tozzi da 250 ml contenenti 100 ml di acido cloridrico acquoso al 5% (HCl), acido nitrico acquoso al 5% (HNO3) e 10% EDTA. Quindi, sono stati trasferiti al forno a microonde e i campioni sono stati irradiati per dieci cicli di dieci secondi ciascuno (a intervalli di 15 minuti) per un tempo totale di 2-4 ore per decalcificatori acidi (5% HNO3 e 5% HCl). La temperatura della soluzione decalcificante è stata mantenuta a circa 41-43°C. La soluzione decalcificante e l’endpoint della decalcificazione sono stati controllati e la soluzione decalcificante è stata ripetutamente modificata fino al completamento della decalcificazione. Il punto finale della decalcificazione è stato controllato utilizzando ossalato di calcio e test fisici come sopra. I tempi totali decalcificati medi erano 3 ore e 45 minuti, 5 ore e 30 minuti e 29 ore e 4 minuti per acido nitrico al 5%, HCl al 5% e EDTA al 10%, rispettivamente. Dopo la completa decalcificazione, i tessuti sono stati lavati con acqua distillata e trasferiti in soluzione di ammoniaca allo 0,3% per 5 minuti per neutralizzare l’acido utilizzato.

2.3. Trattamento e colorazione dei tessuti

I campioni sono stati sottoposti a trattamento automatico dei tessuti utilizzando i seguenti protocolli: le biopsie ossee sono state poste in soluzione salina formale al 10% per un’ora. Poi, 50% di alcol un’ora, 70% di alcol un’ora, 90% di alcol un’ora, seguita da 100% di alcol tre cambiamenti ogni due ore ciascuno, xilene due cambiamenti, ciascuno per uno e mezz’ora, infine cera di paraffina due cambiamenti ciascuno per due ore. I tessuti sono stati incorporati in blocchi di paraffina e sono stati sezionati ad uno spessore di 5-6 µm utilizzando un microtomo rotante. Le sezioni sono state macchiate con l’ematossilina di Mayer, come descritto da Mayer nel 1903, e la contro tinta in ciascuna era l ‘ 1% di eosina (HE) . La macchia di Gridley fu usata per la dimostrazione dei funghi come descritto da Gridley nel 1953); dopo la deparaffinizzazione e la reidratazione, le sezioni di tessuto sono state poste in acido cromico al 2% per 30 minuti. Sono stati quindi lavati bene con acqua di rubinetto, risciacquati con acqua distillata e quindi posti nel reagente di Schiff per 20 minuti. Sono stati poi lavati in acqua corrente del rubinetto per 10 minuti e risciacquati con etanolo al 70% e poi con etanolo al 95%. Sono stati contrastati con Metanil giallo per un minuto e risciacquati bene con acqua distillata. Quindi, sono stati disidratati in xilene e montati in distirene, un plastificante e xilene (DPX). Quindi, le sezioni sono state esaminate al microscopio . Inoltre, il Grocott hexamine-argento metodo per funghi come descritto da Grocott, nel 1955, è stato utilizzato in quali sezioni sono state ossidato con il 4% acquosa di acido cromico per un’ora, lavato con acqua per pochi secondi, trattati con 1% di metabisolfito di sodio per un minuto, lavati in acqua corrente per 3 minuti, sciacquare in acqua distillata, posto in preriscaldato a lavorare in argento la soluzione in un bagno di acqua a 60°C per 20 minuti, risciacquate bene in acqua distillata, lavato con acqua corrente per 5 minuti, sottoposto a colorazione di contrasto in luce da lavoro verde per 15 secondi, disidratata e cancellato in xilene e montato in DPX, e infine esaminato al microscopio.

2.4. Valutazione dei risultati

Le sezioni sono state valutate da un istopatologo esperto. La qualità della procedura di decalcificazione e di colorazione risultato sono stati anche valutati e valutati da la regola del pollice, e la qualità di decalcificazione è stata valutata secondo i seguenti criteri: il tempo di decalcificazione, la conservazione morfologica morfologia dei tessuti, e Madurella mycetomatis funghi da LUI; Gridley e Grocott methenamine-colorazione silver è stata classificata da 1 a 4 (1: poveri, 2: fiera, 3: buona, e 4: eccellente) .

2.5. Analisi statistica

L’analisi dei dati è stata eseguita utilizzando il programma SPSS. ANOVA unidirezionale è stata utilizzata per dimostrare l’effetto delle tre soluzioni decalcificanti sull’analisi quantitativa della qualità della sezione e della conservazione dei funghi. Il test Kruskal-Wallis è stato eseguito per determinare se vi fosse una differenza significativa tra le soluzioni testate per ciascuno dei parametri valutati insieme ai due esperimenti. Le differenze con sono state interpretate come statisticamente significative.

3. Risultati

Cinquanta casi di Madurella mycetomatis con grano nero sono stati inclusi nello studio. I piedi erano la regione anatomica più colpita in 48 casi (96%) e due casi (4,0%) nella mano. Per quanto riguarda il tempo di decalcificazione in diversi esperimenti, tra le tre soluzioni testate, la decalcificazione con EDTA al 10% (pH 7.4) ha richiesto il tempo più lungo per il metodo convenzionale (fino a 120 ore rispetto a 29 ore con il microonde) e l’uso di una soluzione acido-decalcificante ha richiesto il tempo più breve che va da 8 ore a 3 ore per La qualità della morfologia tissutale di diversi tipi di soluzioni decalcificanti utilizzando il metodo a microonde di decalcificazione rispetto al metodo convenzionale con la colorazione dell’ematossilina e dell’eosina di Mayer per quanto riguarda l’aspetto nucleare e citoplasmatico ha ottenuto risultati variabili. Inoltre, il 10% dell’osso EDTA-decalcificato sembrava avere un risultato significativamente superiore (valore P utilizzando il test chi-quadrato: 0,023) rispetto al 5% di HNO3 e al 5% di HCl. Eccellente rapporto colorazione era 43 (86%) contro 32 (64%), 42 (84%) rispetto a 18 (36%) e 33 (66%) rispetto a 1 (2%), rispettivamente. Il Grocott methenamine-argento macchia metodo è stato utilizzato per la dimostrazione del Madurella mycetomatis agente eziologico riguardanti la morfologia e la luminosità dei funghi, e sezioni di tessuto decalcificate 10% EDTA, 5% HNO3, e il 5% HCl convenzionali e forno a microonde metodi hanno mostrato significativamente migliore fungine morfologia (P value utilizzando il test chi-quadrato: 0.001) come segue: 33 (66%) rispetto a 32 (64%), 33 (66%) contro il 39 (78%) e 22 (44%) rispetto al 31 (62%), rispettivamente. L’altro fungine macchia utilizzato per Madurella mycetomatis era Gridley macchia riguardanti fungine morfologia e colorazione qualità di ossa decalcificate con il 10% di EDTA, 5% HNO3, e il 5% di HCl con i tradizionali e a microonde metodi che hanno mostrato significativamente migliori risultati (valore di P utilizzando il test chi-quadrato: 0.003) come segue: 43 (86%) rispetto 41 (82%), 32 (64%) versus 34 (68%) e 23 (46%) contro il 35 (70%), rispettivamente. Questi risultati sono riassunti nella Tabella 2. La figura 1 mostra i risultati della colorazione utilizzando diversi agenti e condizioni decalcificanti.

Figura 1

Dimostrazione dei risultati di colorazione utilizzando diversi agenti e condizioni decalcificanti.

4. Discussione

L’identificazione istopatologica dell’agente causale di Madurella mycetomatis è ben consolidata in quanto è la procedura gold standard; tuttavia, il tessuto duro e l’osso richiedono una speciale decalcificazione per preservare la struttura del tessuto e la morfologia dell’agente causale. Gli agenti causali possono essere identificati usando ematossilina ed eosina (HE) e macchie speciali di funghi, quindi l’osso richiede un protocollo standard di decalcificazione che preserva il tessuto, la morfologia dell’agente causale e la capacità di macchia. La decalcificazione ossea è una tecnica noiosa. Richiede settimane e la conservazione della configurazione del tessuto dipende dall’eccellenza e dalla velocità della procedura di decalcificazione. Un nuovo processo utilizzando un forno a microonde è stato realizzato per accelerare il processo di decalcificazione . La selezione dell’agente decalcificante e del modo è fondamentalmente determinata dalla serietà del metodo e i possibili usi dell’energia a microonde nelle tecniche istologiche sono stati documentati per la prima volta da Mayers nel 1970. Questo sistema di metodo di emissione non ionizzante pensato per accelerare il processo di decalcificazione . La cinetica molecolare quindi causare la produzione di cambiamento di energia, che dura fino a quando la radiazione si ferma . In questo studio, i tempi di decalcificazione riportati per la decalcificazione potenziata a microonde e la procedura di decalcificazione convenzionale sono stati rispettivamente di 29 e 120 ore con EDTA al 10% (pH 7,4), tre ore e sette ore con acido nitrico al 5% e cinque e otto ore con HCl al 5%. È chiaro che il metodo di decalcificazione a microonde per il tessuto osseo affetto da infezione da micetoma era significativamente più veloce del metodo convenzionale. Inoltre, l’acido nitrico al 5% aveva una capacità di decalcificazione più rapida seguita da acido cloridrico al 5% e quindi da EDTA (pH 7.4) per entrambi i metodi. Pitol et al. utilizzato un fornello a microonde domestico per la rimozione del calcio dell’osso di ratto con una soluzione di EDTA all ‘ 8,5% e visualizzato una diminuzione del periodo di prova da 45 giorni nel processo convenzionale a 48 h nel processo assistito a microonde. In questo lavoro, la soluzione di EDTA al 10% ha richiesto 120 ore nel metodo convenzionale e 29 ore utilizzando le microonde per ottenere la completa decalcificazione del tessuto osseo affetto da infezione da micetoma. La concentrazione di EDTA nel nostro esperimento era più di Pitol et al.studio. Oltre alle differenze di dimensioni, spessore e tipi di osso, queste possono essere possibili spiegazioni per gli aumenti nel tempo di decalcificazione in Pitol et al.studio che sono stati ridotti nel nostro ambiente. Inoltre, la decalcificazione dell’osso affetto da infezione da micetoma con il metodo convenzionale utilizzando acido nitrico al 5% ha richiesto sette ore, mentre il metodo del forno a microonde ha richiesto tre ore. Risultati comparabili sono stati raggiunti da Balaton e Loget . Inoltre, in questa ricerca, i tempi di decalcificazione sono stati ridotti da altri studi. I tempi di decalcificazione riportati per i metodi convenzionali e a microonde variavano da un giorno e quattro ore a 5 giorni e sono considerati bassi rispetto ad altri studi sull’osso del roditore, che hanno riportato tempi tra 2 e 7 giorni con soluzioni acido-decalcificanti e 10% EDTA (pH 7,4), rispettivamente . Shibata e il suo gruppo hanno riportato tempi di decalcificazione quasi simili che variavano da 1 giorno a 7 giorni con il 10% di HCl, il 10% di acido nitrico e il 10% di EDTA. Tuttavia, hanno usato decalcificatori acidi con concentrazioni più elevate . et et al. ha valutato gli effetti di quattro diversi fluidi decalcificanti utilizzando la decalcificazione a microonde nell’osso di ratto e ha riportato da 1 a 1,5 giorni per il 5% di acido nitrico e il 7% di HCl/2% di EDTA. Tuttavia, il 10% di EDTA ha richiesto da 14 a 26 giorni in base al tipo di osso . In questi studi, il tipo di osso, la natura e le dimensioni variavano e differivano da quelli analizzati qui. La procedura di decalcificazione è stata una ragione chiave per la superiorità della sezione del tessuto e la precisione della colorazione. Philipp et al. (2019) ha descritto che il metodo di decalcificazione causa cambiamenti morfologici significativi che alterano la struttura proteica e influenzano la capacità di colorazione del tessuto . Nel nostro studio, l’osso è stato trattato con acido nitrico al 5% con il metodo manuale di routine, e c’era gonfiore nei tessuti molli e perdita di colorazione nucleare e fungina rispetto alla decalcificazione assistita da microonde. Gli agenti acido-decalcificanti di solito disturbano la costanza ossea e dei tessuti molli. Questi effetti speciali in acido nitrico 5% sono a causa del periodo preso e l’acidità della soluzione. Pertanto, una decalcificazione più rapida causerà lesioni maggiori e effetti maggiori in H & E e macchia speciale fungina. Diversi funghi possono essere dimostrati con una sezione istologica utilizzando macchie istochimiche come la macchia di metenamina-argento (GMS) di Grocott e/o la macchia di Gridley (GS). Alcuni funghi possono essere dimostrati esattamente in tessuto basato sulle strutture morfologiche; tuttavia, l’efficacia di riconoscimento ha teso a diminuire dopo la fissazione prolungata e la decalcificazione facendo uso dei metodi convenzionali . In questo studio, la decalcificazione assistita da microonde ha dato una colorazione superiore rispetto al metodo convenzionale per la morfologia utilizzando H&E e la macchia speciale fungina, dove il 10% di EDTA era la soluzione che meglio conservava le strutture tissutali e la capacità di colorazione fungina nonostante richiedesse molto tempo per la decalcificazione.

5. Conclusioni e raccomandazioni

La decalcificazione potenziata dall’uso di un forno a microonde è una nuova tecnica per la decalcificazione. Questa tecnica è stata studiata nel tessuto osseo affetto da infezione da Madurella mycetomatis utilizzando il 10% di EDTA, il 5% di acido nitrico e il 5% di acido cloridrico come fluidi decalcificanti. Questo è stato confrontato con la decalcificazione convenzionale a temperatura ambiente per determinare la velocità di decalcificazione e la morfologia del tessuto utilizzando la macchia di Mayer di ematossilina ed eosina per la struttura ossea e le macchie di Grocott e Gridley per la morfologia fungina. Risultati migliori sono stati raggiunti rispetto al metodo convenzionale sia nella morfologia cellulare e funghi spore eph con ridotta luminosità funghi a temperatura ambiente. Questa scoperta può aiutare a sviluppare protocolli adeguati per le analisi del tessuto osseo affetto da infezione da micetoma.

6. Limitazioni del presente studio

Una dimensione del campione più ampia avrebbe dato risultati più conclusivi. Inoltre, è probabile che i tempi di decalcificazione siano diversi se vengono utilizzati diversi pesi ossei e campioni ossei diversi dalle mani poiché il tempo di decalcificazione dipende dalle dimensioni e dalla densità strutturale del tessuto duro. Infine, poiché abbiamo usato un forno a microonde domestico, le nostre registrazioni di temperatura potrebbero essere state solo approssimative.

Disponibilità dei dati

I set di dati generati durante lo studio in corso sono disponibili presso l’autore corrispondente su ragionevole richiesta.

Approvazione etica

Questo studio è stato approvato dal Comitato di revisione istituzionale della Facoltà di Scienze mediche di laboratorio, Università di Al Neelain.

Conflitti di interesse

L’autore dichiara che non vi sono conflitti di interesse.

Ringraziamenti

L’autore desidera esprimere la sua sincera gratitudine al personale del Centro di Ricerca Mycetoma, Università di Khartoum, Khartoum, Sudan, e un apprezzamento speciale ai professori Ahmed Hassan Fahal e Ahmed Mohammed El Hassan, professore emerito di patologia, per la loro assistenza.

Materiali supplementari

I materiali e i reagenti utilizzati a sostegno dei risultati di questo studio sono inclusi nelle informazioni supplementari. (Materiali supplementari)