10.4.2 Trealosio per la crioconservazione delle cellule di mammifero
La crioconservazione è stata comunemente impiegata per la conservazione delle cellule per lunghi periodi a temperature estremamente basse. Tuttavia, i cambiamenti fisici che si verificano durante il congelamento e lo scongelamento possono essere dannosi per la sopravvivenza e le funzioni cellulari. Quindi i crioprotettori devono essere aggiunti alle cellule durante la crioconservazione. L’uso del trealosio come crioprotettore per le cellule è emerso dalla nozione che i composti poliidrossi sono necessari su entrambi i lati della membrana cellulare affinché le cellule siano conservate per periodi più lunghi . Il trealosio è stato esplorato da diversi gruppi come protettivo per la crioconservazione di varie cellule umane.
Beattie et al. introdotto il trealosio insieme al DMSO nelle cellule pancreatiche di Langerhans utilizzando la transizione di fase liquida termotropica . La crioconservazione con trealosio ha portato al recupero del 92% delle isole adulte, rispetto al recupero solo del 58% con DMSO da solo. Quattordici volte più insulina è stata trovata negli innesti da isolotti crioconservati con trealosio rispetto a quelli senza trealosio. Il recupero dei cluster di cellule fetali (Css) crioconservati con trealosio è stato del 94%, rispetto al solo 42% per quelli senza trealosio. Quando trapiantato in topi nudi, è stato osservato un aumento di 15 volte del contenuto di insulina degli innesti da cry crioconservato con trealosio. Questi risultati indicano che l’aggiunta di trealosio come crioconservatore porta a tassi di sopravvivenza molto elevati del tessuto endocrino pancreatico umano.
Toner e colleghi hanno introdotto basse concentrazioni di trealosio nelle cellule di mammifero utilizzando una versione geneticamente modificata della proteina alfa-emolisina che forma i pori e hanno scoperto che il trealosio intracellulare può migliorare notevolmente la sopravvivenza di queste cellule durante la crioconservazione . I tassi di sopravvivenza post-disgelo a lungo termine dei fibroblasti murini crioconservati e dei cheratinociti umani sono stati rispettivamente dell ‘ 80% e del 70%, ad una concentrazione intracellulare di trealosio di 0,2 M. Il trealosio intracellulare è stato anche trovato per avere un effetto benefico sull’integrità della membrana delle cellule di mammifero essiccate, con oltre il 90% di recupero della membrana plasmatica intatta osservato dopo l’essiccazione e la conservazione delle cellule in condizioni miti per diverse settimane .
L’effetto del trealosio sulla crioconservazione degli epatociti umani è stato studiato da Katenz et al. . Le cellule epatiche congelate in terreno di coltura con DMSO 10% e trealosio 0.2 M hanno mostrato un miglioramento significativo della vitalità cellulare post-disgelo e dell’efficienza di placcatura rispetto al solo DMSO. La presenza di trealosio durante la crioconservazione ha portato anche ad un aumento del livello totale di proteine nelle cellule attaccate, livelli di secrezione di albumina più elevati e livelli di aspartato amino transferasi più bassi dopo lo scongelamento.
Le cellule staminali sono strumenti importanti per lo studio dell’emopoiesi, lo sviluppo di nuove strategie terapeutiche e sistemi modello per alcune malattie. Nonostante gli sviluppi nella crioconservazione, la morte cellulare post-disgelo rimane un problema importante. Martinetti et al. trealosio usato per crioconservare staminali ematopoietiche puri e cellule progenitrici dal sangue periferico al fine di prevenire la perdita di cellule che si verifica durante il normale corso di crioconservazione . È stata valutata l’espressione del marcatore staminale di superficie CD34 e si è riscontrato che 1 M di trealosio fornisce una migliore crioprotezione alle cellule CD34+ con numero di cellule e vitalità cellulare più elevati rispetto al metodo di congelamento standard utilizzando DMSO. Inoltre, la crioconservazione con trealosio per periodi più brevi e più lunghi ha mantenuto la capacità delle cellule CD34+ di differenziarsi in cellule megacariopoietiche dopo lo scongelamento. Questi risultati suggeriscono la capacità del trealosio di mantenere la vitalità e le funzioni delle cellule staminali quando usato come crioprotettore.
La conservazione a lungo termine dei globuli rossi (globuli rossi) e delle piastrine, pur mantenendo un alto grado di vitalità, ha importanti implicazioni nella trasfusione di sangue e nella medicina clinica. Satpathy et al. descritto un metodo per caricare i globuli rossi con trealosio da un mezzo extracellulare utilizzando uno squilibrio osmotico e una transizione di fase fosfolipidica che ha portato a concentrazioni intracellulari di trealosio di 40 mm . È stato trovato che il trealosio esercita una protezione osmotica dei globuli rossi per periodi più lunghi. La liofilizzazione dei globuli rossi caricati con trealosio seguita da reidratazione ha portato a una sopravvivenza del 55% con ritenzione della loro morfologia. Le cellule sopravvissute sintetizzavano ATP e 2,3-difosfoglicerato (DPG) e avevano bassi livelli di metaemoglobina. L’attività della SOD e della catalasi e la struttura secondaria dell’emoglobina nei globuli rossi liofilizzati erano tutte molto simili a quelle dei globuli rossi freschi. Questo studio ha dimostrato che il carico di trealosio era necessario per la stabilizzazione dell’emoglobina e ha fornito un passo importante verso la crioconservazione dei globuli rossi.
Il normale tempo di conservazione delle piastrine del sangue umano nelle banche del sangue è di 5 giorni dopo i quali vengono scartate, con conseguente carenza cronica di piastrine necessarie per la trasfusione. Come uno sforzo verso la crioconservazione delle piastrine per periodi più lunghi, Wolkers et al. descritto un metodo per introdurre il trealosio nel citoplasma delle piastrine del sangue umano . Il trealosio è stato trovato per essere rapidamente uptaken dalle piastrine umane a 37 ° C con un’efficienza di carico di più di 50%. La liofilizzazione e la reidratazione delle piastrine cariche di trealosio hanno portato a un eccellente recupero delle piastrine intatte con un tasso di sopravvivenza dell ‘ 85%. Queste piastrine hanno risposto in modo quasi identico alle piastrine fresche verso agonisti come trombina, ADP, collagene e ristocetina. I microdomini di membrana e i componenti proteici delle piastrine cariche di trealosio sono stati mantenuti intatti dopo la liofilizzazione e la reidratazione.
L’effetto protettivo del trealosio è stato dimostrato anche nelle cellule epiteliali corneali essiccate. La preincubazione di cellule epiteliali corneali coltivate con trealosio seguita da essiccazione ha comportato una significativa riduzione della percentuale di cellule morte, rispetto al mezzo di controllo . L’effetto protettivo è stato confermato anche ex vivo negli occhi di suini enucleati, dove il tessuto incubato con trealosio era visibilmente più liscio . Questi risultati indicano l’utilità del trealosio in oftalmologia e la sua potenziale applicazione come collirio per la sindrome dell’occhio secco.
L’uso del trealosio per la crioconservazione degli organelli è stato dimostrato da Yamaguchi et al., che ha usato il trealosio come crioprotectant per i mitocondri congelati . I mitocondri congelati in presenza di trealosio mostravano integrità e reattività della membrana esterna mitocondriale (MOM) alle proteine della famiglia Bcl-2 simili a quelle dei mitocondri freschi. L’ultrastruttura, la sintesi di ATP, il potenziale transmembrana, il gonfiore indotto dal calcio e l’importazione e l’elaborazione di proteine precursori sono stati conservati anche in presenza di trealosio. Ciò è a differenza dell’amplificatore standard del saccarosio-mannitolo usato per il congelamento dei mitocondri che spesso diventa che perde. Così trealosio è stato in grado di mantenere la maggior parte delle caratteristiche biologiche dei mitocondri e trealosio-congelato mitocondri può essere utilizzato per la ricerca su apoptosi e altre funzioni mitocondriali che si basano su integrità MAMMA.
Il trealosio è stato utilizzato per la conservazione degli organi per lunghi periodi. Una “soluzione ET-Kyoto” è stata sviluppata dal gruppo Wada per la conservazione del polmone canino per >30 ore senza influire sulle prestazioni delle cellule endoteliali e della vascolarizzazione . La stabilizzazione prolungata e la conservazione dei vaccini e degli anticorpi inoltre sono state raggiunte facendo uso del trealosio.
