morsetti sono presenti in tutti i domini della vita che sono essenziali per l’efficienza e la replicazione del DNA, che è richiesto ogni volta che una cellula si divide, nonché per coordinare il traffico sul DNA. L’Escherichia coli (E. coli) beta-clamp è una proteina a forma di anello costituita da due monomeri identici codificati dal gene dnaN che si associa alla DNA polimerasi III e facilita l’alto grado di processività richiesto per la replicazione del DNA. Le proteine scorrevoli del morsetto si aprono e sono caricate sulle strutture specifiche del DNA dai caricatori del morsetto in presenza di ATP. Miriamo a ottenere informazioni sui contributi di diversi domini alla funzione di beta utilizzando un linked-beta-clamp che vincola l’omodimero a una delle due interfacce. Di solito la struttura omodimerica del beta-clamp consente di agire come una cintura di strumenti molecolari, legando più di una proteina contemporaneamente a specifici siti di interazione proteica sul morsetto. Pertanto, una migliore comprensione del ruolo dei morsetti scorrevoli nel processo di tolleranza al danno del DNA sarà raccolta studiando se un’interfaccia o un sito di legame sono adeguati per il caricamento del DNA o per altre interazioni proteiche. Per creare questo costrutto, la lunghezza e la sequenza del linker, nonché le condizioni di espressione, sono state ottimizzate. Le proteine beta collegate sono state caratterizzate attraverso un test di denaturazione termica e hanno mostrato una stabilità termica paragonabile alla beta di tipo selvaggio. In un test di ATPasi, quantità simili di fosfato inorganico sono state rilevate in reazioni contenenti beta legata o beta wild-type, indicando che il caricatore a pinza può interagire con entrambe le versioni del morsetto beta. Attualmente, stiamo studiando se linked e wild‐type beta migliorare la processività di una polimerasi in un test di estensione primer. Ora stiamo costruendo e caratterizzando varianti di beta wild-type e linked‐beta per testare l’importanza dei residui in una sola delle interfacce o dei siti di legame proteico partner.
