La colorazione multicolore con coloranti fluorescenti viene utilizzata attivamente per osservare la distribuzione di materiali biologici (come proteine, lipidi, acidi nucleici e ioni) nel campo della ricerca tissutale e cellulare. La tecnologia di rilevamento per l’osservazione della fluorescenza è avanzata fino a un livello in cui una singola molecola di colorante fluorescente può essere rilevata nelle migliori circostanze. Questa sezione esamina alcuni degli aspetti importanti della fluorescenza lifetime imaging microscopia (FLIM), una nuova tecnologia di microscopia a fluorescenza. Oltre alla colorazione multicolore, l’imaging a vita di fluorescenza può anche essere utilizzato per visualizzare i fattori che influenzano le proprietà della durata della fluorescenza della molecola di colorante, cioè lo stato dell’ambiente attorno alla molecola.
Spettroscopia di lunghezza d’onda
La microscopia convenzionale di fluorescenza fa uso delle proprietà di colore delle tinture fluorescenti, cioè, l’identificazione è basata sulle differenze nelle caratteristiche spettrali di fluorescenza fra le tinture. Con questa tecnica, cinque o sei coloranti nella gamma di lunghezze d’onda dall’ultravioletto al vicino infrarosso possono essere utilizzati contemporaneamente al microscopio senza confusione tra i colori.
Spettroscopia a vita
Ogni colorante fluorescente ha una propria durata nello stato eccitato. Rilevando le differenze nella vita, è possibile distinguere anche i coloranti aventi lo stesso colore fluorescente e identificare l’autofluorescenza. Inoltre, è possibile ottenere immagini segnale-rumore elevate utilizzando una sonda con una durata molto lunga rispetto a quella dei coloranti fluorescenti normalmente utilizzati. Ad esempio, la coproporfirina di platino ha una durata di millisecondi mentre le vite dei normali coloranti fluorescenti sono di ordine nanosecondo. Tali coloranti fluorescenti relativamente longevi saranno presto utilizzati come sonde per il rilevamento del DNA sui chip.
L’imaging a vita in fluorescenza consente anche di ottenere informazioni sulle molecole osservando una cellula vivente. I fattori che influenzano la durata della fluorescenza includono l’intensità degli ioni, le proprietà idrofobiche, la concentrazione di ossigeno, il legame molecolare e l’interazione molecolare mediante trasferimento di energia quando due proteine si avvicinano l’una all’altra. La durata è, tuttavia, indipendente dalla concentrazione del colorante, dal photobleaching, dalla dispersione della luce e dall’intensità della luce di eccitazione. Pertanto, la fluorescenza lifetime imaging ci consente di eseguire misurazioni accurate della concentrazione di ioni e analisi FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer).
Esistono due metodi di imaging della durata della fluorescenza: il metodo del dominio del tempo e il metodo del dominio della frequenza.
- FLIM nel dominio del tempo-In alcuni casi di ritardo dopo l’eccitazione da parte di un laser a impulsi, l’immagine a fluorescenza può essere ottenuta mediante l’operazione di gate dell’intensificatore di immagine. La durata è misurata in nanosecondi da un laser con una durata dell’impulso di poche centinaia di picosecondi e un otturatore a livello di nanosecondi perché la durata di uno stato di eccitazione è di solito da 1 a 20 nanosecondi. Un intensificatore di immagini per gate ad alta velocità è disponibile in commercio presso Hamamatsu Photonics KK (Hamamatsu, Giappone). La durata della fluorescenza ad ogni pixel può anche essere ottenuta misurando variando il tempo di ritardo fino all’apertura di un cancello. Le immagini di vita della fluorescenza sono indicate in pseudocolor secondo le loro vite.
- Frequency-domain FLIM-Fluorescence lifetime è calcolato misurando lo sfasamento della fluorescenza e la riduzione della sua ampiezza utilizzando un rivelatore con un modulatore di guadagno quando il laser utilizzato come sorgente luminosa di eccitazione è modulato (da 1 a 200 megahertz). La misurazione può essere effettuata mediante scansione laser (fotomoltiplicatore) o utilizzando un dispositivo ad accoppiamento di carica (CCD).
Applicazioni
L’ambiente che circonda la sonda viene rilevato in base al fatto che la durata della fluorescenza è sensibile alla concentrazione di ioni idrogeno (pH), ossigeno e concentrazioni di ioni calcio. Il legame o l’interazione tra molecole possono anche essere misurati in combinazione con FRET.
Imaging della concentrazione di ioni calcio
Quando lo ion calcio si lega a una sonda fluorescente come Fura-2, Fluo-3 o Calcio Verde, cambia sia la durata della fluorescenza che l’intensità della fluorescenza. La procedura convenzionale per la misurazione della concentrazione di ioni si concentra sul cambiamento di intensità. Secondo il cambiamento della concentrazione dello calcium del calcio, il rapporto delle tinture fra i cambiamenti legati e non legati dello calcium del calcio e questo successivamente piombo ad un cambiamento nella vita della fluorescenza del punto di misurazione nell’esemplare. Oltre alla sonda di ioni di calcio, questa tecnica è applicabile anche alla misurazione del pH e di altri ioni come lo sodium di sodio e lo magnesium di magnesio.
Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET)
La ricerca è attualmente condotta su FRET da varianti di proteine fluorescenti verdi (GFP) (GFP con un diverso colore di fluorescenza). FRET consente di misurare le interazioni (associazione o dissociazione) tra due proteine etichettate con una coppia di coloranti a fluorescenza. Un colorante fluorescente donatore ha lunghezze d’onda di eccitazione/emissione più brevi che forniscono energia a un colorante a fluorescenza accettore. La durata dello stato di eccitazione del colorante donatore è variabile a seconda che esista o meno l’accettore (il colorante che riceve l’energia). La misurazione basata sulla durata consente una migliore quantificazione perché non è necessario considerare la sovrapposizione della fluorescenza durante il rilevamento.
Imaging clinico
Poiché alcuni campioni di tessuto e citodiagnostici hanno una forte autofluorescenza, è stato tentato l’uso di sonde con lunghe vite (fino a millisecondi). Le sonde a lunga durata sono utili anche nell’ibridazione in situ a fluorescenza (FISH) perché il numero di colori che possono essere utilizzati contemporaneamente è limitato con questa tecnica. La concentrazione di ioni idrogeno nel sangue, così come le pressioni di ossigeno e anidride carbonica, sono già state misurate in base alla durata della fluorescenza, sebbene tali misurazioni non siano ancora possibili al microscopio.
Risorse Internet
- Centro per la spettroscopia di fluorescenza – Ospitato dal professor Joseph R. Lakowicz presso l’Università del Maryland, questo sito è una risorsa eccellente per informazioni sulla fluorescenza lifetime imaging e altri aspetti della spettroscopia di fluorescenza e microscopia.
- Kentech Instruments-Kentech produce generatori di impulsi a stato solido ad alta tensione e sistemi ottici di imaging gated per l’imaging a vita in fluorescenza.
- Hamamatsu Photonics-Oltre alla loro eccellente gamma di sistemi di fotocamere digitali, Hamamatsu produce anche fotomoltiplicatori, fotodiodi a valanga e intensificatori di immagini ad alta velocità.
- PRS BioSciences-Specializzata nella microscopia a fluorescenza biologica, PRS BioSciences produce un sistema time-gated aftermarket che può essere adattato a molti microscopi di ricerca.
