G418

G418 (Geneticin, Invitrogen): Sciogliere in acqua, a 200 mg/ml, filtro sterilizzare e conservare in aliquote a 4 °C.

clonNAT (nourseothricin, Werner BioAgents, Jena, Germania): Sciogliere in acqua a 100 mg/ml, filtro sterilizzare e conservare in aliquote a 4 °C.

Canavanine (l-canavanine solfato di sale, Sigma, C-9758): Sciogliere in acqua a 100 mg/ml, filtro sterilizzare e conservare in aliquote a 4 °C.

Thialysine (S-(2-aminoethyl)-l-cisteina cloridrato, Sigma, Un-2636): Dissolve in water at 100 mg/ml, filter sterilize, and store in aliquots at 4 °C.

Amino acids supplement powder mixture for synthetic media (complete): Contains 3 g adenine (Sigma), 2 g uracil (ICN), 2 g inositol, 0.2 g para-aminobenzoic acid (Acros Organics), 2 g alanine, 2 g arginine, 2 g asparagine, 2 g aspartic acid, 2 g cysteine, 2 g glutamic acid, 2 g glutamine, 2 g glycine, 2 g histidine, 2 g isoleucine, 10 g leucine, 2 g lysine, 2 g methionine, 2 g phenylalanine, 2 g proline, 2 g serine, 2 g threonine, 2 g tryptophan, 2 g tyrosine, and 2 g valine (Fisher). Drop-out (DO) miscela di polvere è una combinazione degli ingredienti di cui sopra meno il supplemento appropriato. Due grammi della miscela di polvere DO vengono utilizzati per litro di mezzo.

Integratore di aminoacidi per mezzo di sporulazione: contiene 2 g di istidina, 10 g di leucina, 2 g di lisina, 2 g di uracile; 0,1 g della miscela di integratori di aminoacidi in polvere viene utilizzata per litro di mezzo di sporulazione.

Glucosio (destrosio, Fisher): preparare una soluzione al 40%, in autoclave e conservare a temperatura ambiente.

YEPD: Aggiungere 120 mg di adenina (Sigma), 10 g di estratto di lievito, 20 g di peptone, 20 g di bacto agar (BD Difco) a 950 ml di acqua in un pallone da 2 l. Dopo l’autoclave, aggiungere 50 ml di soluzione di glucosio al 40%, mescolare accuratamente, raffreddare a ~ 65 °C e versare le piastre.

YEPD + G418: raffreddare il mezzo YEPD a ~ 65 ° C, aggiungere 1 ml di soluzione madre G418 (concentrazione finale 200 mg / l), mescolare accuratamente e versare le piastre.

YEPD + clonNAT: raffreddare il terreno di YEPD a ~ 65 ° C, aggiungere 1 ml di soluzione madre di clonNAT (concentrazione finale 100 mg / l), mescolare accuratamente e versare le piastre.

YEPD + G418 / clonNAT: Raffreddare il mezzo YEPD a ~ 65 °C, aggiungere 1 ml di G418 (concentrazione finale 200 mg/l) e 1 ml di clonNAT (concentrazione finale 100 mg/l) soluzioni stock, mescolare accuratamente e versare le piastre.

Sporulazione arricchita: aggiungere 10 g di acetato di potassio (Fisher), 1 g di estratto di lievito, 0,5 g di glucosio, 0,1 g di aminoacidi miscela in polvere per sporulazione, 20 g di bacto agar a 1 l di acqua in un pallone da 2 l. Dopo l’autoclave, raffreddare a ~ 65 °C, aggiungere 250 µl di soluzione madre G418 (concentrazione finale 50 mg / l), mescolare accuratamente e versare le piastre.

(SD/MSG) − His/Arg/Lys + canavanina/tialisina/G418: Aggiungere 1,7 g di base di azoto di lievito senza aminoacidi o solfato di ammonio (BD Difco), 1 g di MSG (acido l-glutammico sale di sodio idrato, Sigma), 2 g di miscela di integratori di aminoacidi in polvere (DO − His/Arg/Lys), 100 ml di acqua in un pallone da 250 ml. Aggiungere 20 g di bacto agar a 850 ml di acqua in un pallone da 2 l. Autoclave separatamente. Combinare soluzioni autoclavate, aggiungere 50 ml di glucosio al 40%, raffreddare il mezzo a ~ 65 °C, aggiungere 0,5 ml di canavanina (50 mg/l), 0,5 ml di tialisina (50 mg/l) e 1 ml di soluzioni stock G418 (200 mg/l), mescolare accuratamente e versare le piastre. Il solfato di ammonio impedisce la funzione di G418 e clonNAT. Quindi, il mezzo sintetico contenente questi antibiotici è realizzato con acido glutammico monosodico come fonte di azoto (Cheng et al., 2000).

(SD/MSG) − His/Arg/Lys + canavanina/tialisina/clonNAT: Aggiungere 1,7 g di base di azoto di lievito senza aminoacidi o solfato di ammonio, 1 g di MSG, 2 g di miscela di integratori di aminoacidi in polvere (DO − His/Arg/Lys), 100 ml di acqua in un pallone da 250 ml. Aggiungere 20 g di bacto agar a 850 ml di acqua in un pallone da 2 l. Autoclave separatamente. Combinare soluzioni autoclavate, aggiungere 50 ml di glucosio al 40%, raffreddare a ~ 65 °C, aggiungere 0.5 ml di canavanina (50 mg/l), 0,5 ml di tialisina (50 mg/l) e 1 ml di clonNAT (100 mg/l), mescolare accuratamente e versare le piastre.

(SD/MSG) − His/Arg/Lys + canavanina/tialisina/G418/clonNAT: Aggiungere 1,7 g di base di azoto di lievito senza aminoacidi o solfato di ammonio, 1 g di MSG, 2 g di miscela di integratori di aminoacidi in polvere (DO − His/Arg/Lys), 100 ml di acqua in un pallone da 250 ml. Aggiungere 20 g di bacto agar a 850 ml di acqua in un pallone da 2 l. Autoclave separatamente. Combinare soluzioni autoclavate, aggiungere 50 ml di glucosio al 40%, raffreddare a ~ 65 °C, aggiungere 0,5 ml di canavanina (50 mg/l), 0.5 ml di tialisina (50 mg/l), 1 ml di G418 (200 mg/l) e 1 ml di clonNAT (100 mg/l), mescolare accuratamente e versare le piastre.

(SD/MSG) Completo: Aggiungere 1,7 g di base di azoto di lievito senza aminoacidi o solfato di ammonio, 1 g di MSG, 2 g di miscela di integratori di aminoacidi in polvere (completa), 100 ml di acqua in un pallone da 250 ml. Aggiungere 20 g di bacto agar a 850 ml di acqua in un pallone da 2 l. Autoclave separatamente. Unire le soluzioni autoclavate, aggiungere 50 ml di glucosio al 40%, mescolare accuratamente, raffreddare a ~ 65 °C e versare le piastre.

SD − His / Arg / Lys + canavanina / tialisina: Aggiungere 6.7 g base di azoto di lievito senza aminoacidi (BD Difco), 2 g miscela di integratori di aminoacidi in polvere (DO − His/Arg/Lys), 100 ml di acqua in un pallone da 250 ml. Aggiungere 20 g di bacto agar a 850 ml di acqua in un pallone da 2 l. Autoclave separatamente. Combinare soluzioni autoclavate, aggiungere 50 ml di glucosio al 40%, raffreddare a ~ 65 °C, aggiungere 0,5 ml di canavanina (50 mg / l) e 0,5 ml di tialisina (50 mg/l), mescolare accuratamente e versare le piastre. Questo mezzo non contiene antibiotici come G418 o clonNAT e quindi il solfato di ammonio viene utilizzato come fonte di azoto.

SD − Leu/Arg/Lys + canavanina/tialisina: Aggiungere 6,7 g di base di azoto di lievito senza aminoacidi, 2 g di miscela di integratori di aminoacidi in polvere (DO-Leu/Arg/Lys), 100 ml di acqua in un pallone da 250 ml. Aggiungere 20 g di bacto agar a 850 ml di acqua in un pallone da 2 l. Autoclave separatamente. Combinare soluzioni autoclavate, aggiungere 50 ml di glucosio al 40%, raffreddare a ~ 65 °C, aggiungere 0,5 ml di canavanina (50 mg / l) e 0,5 ml di tialisina (50 mg/l), mescolare accuratamente e versare le piastre.