Giemsa Stain :Principio, procedura e risultati

Giemsa stain è un tipo di macchia Romanowsky, dal nome di Gustav Giemsa, un chimico tedesco che ha creato una soluzione colorante. È stato progettato principalmente per la dimostrazione di parassiti malarici in strisci di sangue, ma è anche impiegato in istologia per l’esame di routine di striscio di sangue.

Usi di Giemsa Stain

Oltre a macchiare i parassiti malarici, Giemsa stain ha una varietà di applicazioni in microbiologia e patologia:

• Giemsa stain viene utilizzato per ottenere la conta differenziale dei globuli bianchi.
• È anche usato per differenziare la morfologia nucleare e citoplasmatica delle varie cellule del sangue come piastrine, globuli rossi, globuli bianchi.
• In Microbiologia, Giemsa macchia viene utilizzato per la colorazione corpi di inclusione in Chlamydia trachomatis, Borrelia specie, e se la macchia di Wayson non è disponibile, per macchiare Yersinia pestis. Giemsa stain è anche usato per macchiare Histoplasma capsulatum, Pneumocystis jiroveci, Klebsiella granulomatis, Penicillium marneffei e occasionalmente capsule batteriche.
• Questa macchia è utilizzata anche in citogenetica per macchiare i cromosomi e identificare le aberrazioni cromosomiche. È comunemente usato per G-banding (Giemsa-Banding)

Principio di Giemsa Stain

Giemsa stain è una macchia differenziale e contiene una miscela di azzurro, blu di metilene e colorante Eosina. È specifico per i gruppi fosfatici del DNA e si attacca a dove ci sono elevate quantità di legame adenina-timina.

L’azzurro e l’eosina sono coloranti acidi che colorano in modo variabile i componenti di base delle cellule come il citoplasma, i granuli ecc.

Il blu di metilene agisce come colorante di base, che colora i componenti acidi, in particolare il nucleo della cellula.

Il metanolo agisce come fissativo e come macchia cellulare. Il fissativo non consente ulteriori cambiamenti nelle cellule e le fa aderire al vetrino.

Composizione di Giemsa Stain

Giemsa stain può essere preparato in casa utilizzando Giemsa stain powder o può essere ottenuto commercialmente. Gli ingredienti di base di entrambi sono gli stessi; tuttavia, le diluizioni possono essere fatte a seconda dell’uso.

PROCEDURA

A. Per la preparazione di macchia:

1. Pesare la quantità necessaria di polvere, macchie, e il trasferimento ad un pulito e secco, 1 litro di capacità della bottiglia. Aggiungere il metanolo e mescolare bene.
2. Misurare e aggiungere glicerolo e mescolare bene.
3. Mettere la bottiglia di macchia in bagno d’acqua a 50-60°C o a 37°C per un massimo di 2 ore con frequenti miscelazione.
4. Etichettare il flacone e conservarlo in un luogo fresco e buio con un tappo fermo.

NOTA: Se l’acqua entra in contatto durante le fasi di preparazione della macchia, la macchia si guasta, quindi utilizzare, asciugare la vetreria e conservare in condizioni in cui non ci sarebbe contatto con l’acqua.

• Filtrare la macchia utilizzando la carta filtrante Whatman n.1 e diluire con acqua tamponata a pH 7.2 per ottenere soluzioni di lavoro

B. Per la colorazione dei vetrini

Il metodo di colorazione, concentrazione e tempistica della macchia utilizzato varia a seconda dello scopo, ad esempio, gli strisci di sangue sottili utilizzano una diluizione 1:20 del brodo mentre per lo striscio di sangue spesso viene utilizzata una diluizione 1:50.

ForThin blood striscio

1. Fissare il film essiccato all’aria in metanolo assoluto immergendo brevemente il film (due tuffi) in un barattolo Coplin contenente metanolo assoluto.
2. Rimuovere e lasciare asciugare all’aria.
3. Macchia con macchia Giemsa diluita (1: 20, vol / vol) per 20 min (Per un 1:20 diluizione, aggiungere 2 ml di stock Giemsa a 40 ml di acqua tamponata in un vaso Coplin).
4. Lavare immergendo brevemente il vetrino dentro e fuori da un barattolo Coplin di acqua tamponata (uno o due tuffi).
   Nota: un lavaggio eccessivo decolorerà il film.
5. Lasciare asciugare all’aria in posizione verticale. Osservare sotto il microscopio prima a 40X e poi usando la lente ad immersione in olio

Per gli strisci di sangue spessi

1. Lasciare asciugare completamente il film all’aria per diverse ore o durante la notte. Non asciugare i film in un incubatore o dal calore, perché questo fisserà il sangue e interferirà con la lisatura dei globuli rossi.
   Nota: Se è necessaria una diagnosi rapida della malaria, i film spessi possono essere resi leggermente più sottili del solito, lasciati asciugare per 1 ora e poi macchiati.
2. NON CORREGGERE.
3. Colorare con Giemsa stain diluito (1:50, vol/vol) per 50 min (Per una diluizione di 1:50, aggiungere 1 ml di Giemsa stock a 50 ml di acqua tamponata in un barattolo Coplin)
4. Lavare mettendo la pellicola in acqua tamponata per 3-5 min.
5. Lasciare asciugare all’aria in posizione verticale e osservare al microscopio prima a 40X e quindi utilizzando olio di obiettivo ad immersione

Per Chlamydia trachomatis

Seguire la suddetta procedura, ma con la diluire la macchia di diluizione 1:40 (aggiungere 0,5 ml di brodo di Giemsa soluzione al 19,5 ml tamponata acqua) e lasciare la macchia per 90-120 minuti.

OSSERVAZIONE:

Sull’osservazione microscopica, gli organelli cellulari, i batteri e i parassiti si distinguono in base alla loro morfologia e colore;