Il test TUNEL è più comunemente usato per rilevare le cellule in fase di apoptosi, che è una forma di morte cellulare programmata. L’apoptosi è un importante processo biologico durante lo sviluppo e per il mantenimento dell’omeostasi tissutale. La colorazione TUNEL consente la visualizzazione e la quantificazione delle cellule apoptotiche. Questo aiuta gli scienziati a testare l’efficacia di nuovi trattamenti per i disturbi in cui l’apoptosi è inibita, come nel cancro, o potenziata, come nella neurodegenerazione.
Questo video spiegherà come il test TUNEL può essere utilizzato per etichettare le cellule sottoposte ad apoptosi, un protocollo passo-passo per eseguire questo metodo in sezioni di tessuto, e come i ricercatori stanno applicando questa tecnica per comprendere i meccanismi di morte cellulare.
Prima di approfondire il protocollo del test TUNEL, discutiamo i principi alla base di questa tecnica.
Una delle molte caratteristiche distintive dell’apoptosi è la frammentazione del DNA. Come si verifica la frammentazione del DNA? L’apoptosi viene effettuata da enzimi chiamati caspasi presenti nel citosol. Il loro ruolo primario è quello di fendere le proteine al fine di smantellare la cellula. Inoltre, le caspasi attivano un enzima chiamato DNasi attivata dalla caspasi, o CAD, staccandolo dal suo inibitore—ICAD. La CAD attivata è un’endonucleasi che viaggia verso il nucleo e scinde il DNA cromosomico.
La scissione del DNA alla fine causa l’accumulo di frammenti di DNA con estremità intaccate e il test TUNEL etichetta in modo fluorescente queste estremità intaccate del DNA frammentato, consentendo agli scienziati di rilevare l’apoptosi. Ma come succede? Per questo devi capire la reazione di TUNEL. TUNEL sta per terminale deossinucleotidil transferasi mediata dUTP nick-end etichettatura. I due principali reagenti di TUNEL sono la deossinucleotidil transferasi terminale, o TdT, e la deossiuridina trifosfato, o dUTP, che possono essere etichettati in modo fluorescente per facilità di rilevamento.
Per comprendere la reazione di TUNEL, torniamo alle cellule apoptotiche con frammenti di DNA. Questi frammenti intaccati hanno 3 ‘ gruppi idrossilici liberi. Una volta aggiunti i reagenti TUNEL a un campione contenente cellule apoptotiche, i DUTP etichettati con fluorescenza si attaccano a questi gruppi idrossilici 3’ con l’aiuto dell’enzima catalizzatore TdT. Le cellule macchiate con questa procedura sono chiamate cellule positive TUNEL, che possono quindi essere visualizzate utilizzando la microscopia a fluorescenza.
Ora che comprendi i principi e i concetti di base alla base del test TUNEL, delineiamo un protocollo generale per eseguire questa tecnica in sezioni di tessuto. Le fasi principali del test TUNEL includono il fissaggio del tessuto di interesse, la permeabilizzazione del tessuto, l’aggiunta di reagenti TUNEL, l’arresto della reazione TUNEL e infine l’analisi.
In primo luogo, il tessuto di interesse deve essere fissato al fine di preservare le strutture biologiche. La fissazione funziona reticolando le proteine all’interno delle cellule. Per il test TUNEL, i tessuti possono essere fissati aggiungendoli a una soluzione contenente il 4% di paraformaldeide per 4-24 ore a 4°C. Dopo la fissazione, criosezione del tessuto in fette sottili di 10 µm o meno.
Il passo successivo è la permeabilizzazione, che consente a reagenti come l’enzima TdT di penetrare nel nucleo cellulare. La permeabilizzazione delle sezioni di tessuto può essere eseguita aggiungendo il tessuto alla soluzione di proteinasi K per 5-15 minuti a 37°C. Risciacquare le sezioni di tessuto con soluzione salina tamponata con fosfato su uno shaker orbitale per 15-30 minuti a temperatura ambiente.
In seguito alla permeabilizzazione, l’enzima TdT e i DUTP etichettati in modo fluorescente vengono aggiunti alle sezioni di tessuto, insieme a un tampone di etichettatura contenente cobalto che funge da cofattore per la reazione di TUNEL. Insieme, la miscela di reazione di TUNEL e la sezione di tessuto vengono incubate per 1-3 ore a 37 ° C e protette dalla luce per evitare che la fluorescenza si sbiadisca.
Dopo l’incubazione, il tampone di arresto viene aggiunto alla sezione di tessuto per interrompere la reazione di TUNEL e, dopo una breve incubazione, le sezioni vengono lavate con soluzione salina tamponata con fosfato. Infine, le sezioni di tessuto macchiate con dUTP contrassegnato con fluorescenza vengono visualizzate utilizzando la microscopia a fluorescenza e valutate per la localizzazione di cellule positive di TUNEL all’interno di un dato tessuto. Si può quantificare la morte cellulare semplicemente contando la percentuale di cellule positive di TUNEL in una determinata sezione di tessuto.
Ora che hai visto come eseguire il test TUNEL per rilevare le cellule apoptotiche, discutiamo di come questo test può essere utilizzato per affrontare le domande poste dai biologi cellulari.
La morte cellulare si verifica come una parte normale dello sviluppo per la scultura di tessuti e strutture e per l’eliminazione di cellule non necessarie. Pertanto, gli scienziati interessati a questo fenomeno studiano l’effetto dell’esposizione prenatale a diverse sostanze sull’apoptosi durante lo sviluppo. Qui, gli scienziati erano interessati ad esaminare l’effetto dell’esposizione prenatale all’alcol sullo sviluppo del cervello. I risultati della colorazione di TUNEL eseguita sul cervello fetale hanno rivelato un aumento dell’apoptosi nei tessuti esposti prenatalmente all’alcol, rispetto agli animali di controllo.
Gli scienziati usano anche il test TUNEL per studiare l’apoptosi in risposta all’infezione batterica. In questo esperimento, gli scienziati hanno sviluppato un modello di polmonite iniettando topi con Pseudomonas aeruginosa, che induce l’infiammazione polmonare. Quindi, il tessuto polmonare è stato rimosso e la colorazione di TUNEL è stata eseguita per esaminare l’apoptosi in risposta all’infezione batterica. I risultati mostrano che la morte cellulare apoptotica è aumentata nei topi esposti ai batteri, rispetto agli animali di controllo.
Infine, la colorazione TUNEL può essere utilizzata su campioni tumorali umani, al fine di determinare la reattività del tumore ai farmaci. In questo esempio, campioni di tumore sono stati raccolti da pazienti umani e coltivati ex vivo. Successivamente, sono stati trattati con farmaci pre-clinici e valutati per una risposta utilizzando il test TUNEL. I dati ottenuti mostrano che il trattamento con un farmaco che inibisce la proteina di shock termico 90 aumenta significativamente l’apoptosi nel tessuto tumorale.
Hai appena visto il video di JoVE sull’utilizzo del test TUNEL per rilevare le cellule in fase di apoptosi. Questo video ha esaminato i principi alla base della colorazione TUNEL e un protocollo passo-passo per eseguire il test TUNEL su sezioni di tessuto. Abbiamo anche esaminato come questo metodo potrebbe essere applicato per comprendere la morte cellulare programmata durante lo sviluppo e la malattia. Come sempre, grazie per la visione!
