Proteina chinasi differiscono nella loro distribuzione cellulare e subcellulare, la specificità di substrato e di regolamento
Queste proprietà determinano i ruoli funzionali giocato da più di 70 tipi di proteine chinasi che sono stati trovati nei tessuti dei mammiferi, la maggior parte dei quali sono noti per essere espresso nei neuroni . Le principali classi di proteine serina-treonina chinasi nel cervello, elencate nella Tabella 24-1, sono trattate in questo capitolo. Le principali classi di proteine tirosin chinasi nel cervello sono discusse nel capitolo 25. Tra le protein chinasi meglio studiate nel cervello ci sono quelle attivate dal second messengers cAMP, cGMP, Ca2 + e DAG .
La protein chinasi CAMP-dipendente (protein chinasi A; PKA) è composta da subunità catalitiche e regolatrici. L’oloenzima della chinasi, che consiste in un tetramero di due subunità catalitiche (C) e due regolatrici (R), è inattivo. cAMP attiva l’oloenzima legandosi alle subunità regolatorie, causando così la dissociazione dell’oloenzima in subunità catalitiche libere regolatorie e libere. Tre isoforme della subunità C, ciascuna di circa 40 kDa, e quattro isoforme della subunità R, ciascuna di 50 a 55 kDa, sono state clonate da tessuti di mammiferi. Le tre subunità C, designate Ca, Cß e Cy, presentano una specificità del substrato molto simile e ampia, cioè fosforilano un gran numero di proteine del substrato fisiologico e possono generalmente essere considerate isoforme l’una dell’altra. Le quattro subunità R sono costituite da due forme ciascuna di proteine di tipo I e di tipo II. RIIa e RIIß, ma non RIa e RIß, subiscono autofosforilazione, come descritto di seguito. La maggior parte di queste subunità R e C della protein chinasi mostra un’ampia distribuzione cellulare nel cervello.
L’attività PKA è presente in tutta la cellula, associata alla membrana plasmatica e alle frazioni citoplasmatiche e nucleari. La chinasi è altamente compartimentalizzata all’interno della cellula, in gran parte tramite una serie di proteine di ancoraggio, chiamate proteine di ancoraggio della chinasi (AKAPs) . Sono note diverse forme di AKAP, molte di circa 75-79 kDa. Gli AKAP si legano specificamente con le subunità RIIa e RIIß della protein chinasi e quindi legano queste subunità regolatorie e le loro subunità catalitiche legate a specifici siti subcellulari, ad esempio le densità postsinaptiche. Le densità postsinaptiche sono specializzazioni nei dendriti distali che appose i terminali del nervo presinaptico e si ritiene che contengano alcuni dei recettori del neurotrasmettitore e altre proteine necessarie per la trasmissione sinaptica. In questo modo, AKAPs mantiene la proteina chinasi in prossimità della cascata di proteine di trasduzione del segnale che fosforila per regolare la trasmissione sinaptica. L’importante ruolo svolto da AKAP in condizioni fisiologiche è indicato da esperimenti in cui è stato dimostrato che i polipeptidi sintetici che interrompono le interazioni AKAP—RII interrompono specifici effetti fisiologici della PKA .
La chinasi proteica cGMP-dipendente (PKG) è un dimero di due subunità identiche. Ogni subunità, con un Mr di ~75.000, contiene un dominio normativo, che lega cGMP, e un dominio catalitico . Come con l’enzima cAMP-dipendente, cGMP attiva l’oloenzima inattivo legandosi al dominio normativo della molecola; tuttavia, a differenza dell’enzima cAMP-dipendente, l’attivazione dell’oloenzima cGMP-dipendente non è accompagnata dalla dissociazione delle subunità. Il PKG mostra una distribuzione cellulare e una specificità del substrato molto più limitate rispetto al PKA. Ciò riflette il minor numero di azioni di second-messenger di cGMP nella regolazione della funzione cellulare.
Proteine chinasi calcio/calmodulina-dipendenti (CAM chinasi; CaMKs) sono una delle due principali classi di chinasi calcio-dipendenti nel sistema nervoso. Il cervello contiene almeno sei tipi principali di CaMK, ognuno con proprietà molto diverse. CaMK II, come l’enzima cAMP-dipendente, presenta un’ampia distribuzione cellulare e specificità del substrato e può essere considerato una “proteina chinasi multifunzionale” in quanto probabilmente media molte delle azioni del secondo messaggero di Ca2+ in molti tipi di neuroni . Per analogia con PKG, CaMK II contiene un dominio normativo, che, nello stato di riposo, si lega e inibisce un dominio catalitico; questa inibizione viene alleviata quando Ca2+ / calmodulina si lega al dominio normativo. Diverse isoforme di questo enzima sono state clonate, tra cui più subunità α e β di ~50 e 60 kDa, rispettivamente. L’enzima esiste in condizioni fisiologiche come grandi complessi multimerici di isoforme identiche o distinte.
CaMKs I e IV sembrano anche svolgere un ruolo importante nel mediare molte delle azioni di secondo messaggero di Ca2+ nel sistema nervoso, anche se la loro precisa specificità del substrato rimane solo parzialmente nota . Una caratteristica interessante di CaMK I e IV è che entrambi sembrano essere attivati non solo da Ca2+/calmodulin-binding, ma anche sulla loro fosforilazione da altre chinasi proteiche, che sono stati chiamati CAMK I chinasi e CAMK IV chinasi, rispettivamente . Queste chinasi CaMK possono anche essere enzimi Ca2 + / calmodulina-dipendenti. L’enzima chinasi CaMK IV è stato clonato. È interessante notare che questa chinasi è essa stessa fosforilata e inibita dalla PKA, fornendo così un meccanismo prominente con cui le cascate cAMP e Ca2+ interagiscono, come verrà trattato in dettaglio di seguito.
I restanti tre tipi di CaMK sono fosforilasi chinasi, miosina chinasi a catena leggera e CaMK III . Questi enzimi sembrano fosforilare meno proteine del substrato, e in alcuni casi solo un tipo, in condizioni fisiologiche, e ciascuno può quindi mediare relativamente meno azioni di Ca2+ nel sistema nervoso.
La protein chinasi C (PKC) comprende l’altra classe principale di protein chinasi dipendenti da Ca2+ed è attivata da Ca2+ in combinazione con DAG e fosfatidilserina . Molteplici forme di PKC sono state clonate, e il cervello è noto per contenere almeno sette specie di enzima. Le forme varianti di PKC presentano diverse distribuzioni cellulari nel cervello e diverse proprietà regolatorie. Ad esempio, differiscono nella capacità relativa di Ca2+ e DAG di attivarli: alcuni richiedono sia Ca2+ che DAG, mentre altri possono essere attivati dal solo DAG, apparentemente senza un aumento delle concentrazioni di Ca2+ cellulare. Tuttavia, questi enzimi mostrano specificità di substrato simili e, di conseguenza, sono spesso considerati isoforme.
PKC esiste in condizioni fisiologiche come catene polipeptidiche singole di circa 80 kDa. Ogni polipeptide contiene un dominio regolatore, che, nello stato di riposo, si lega e inibisce un dominio catalitico. Questa inibizione viene alleviata quando Ca2+ e / o DAG si legano al dominio normativo. PKC presenta un’ampia specificità del substrato e media numerose funzioni di secondo messaggero di Ca2 + nei neuroni bersaglio.
In condizioni basali, la PKC è prevalentemente una proteina citoplasmatica. Dopo l’attivazione da Ca2 + o DAG, l’enzima si associa alla membrana plasmatica, il sito di molti dei suoi substrati fisiologici noti, compresi i recettori e i canali ionici. Infatti, la traslocazione di PKC dal citoplasma alla membrana è stata a lungo utilizzata come misura sperimentale dell’attivazione enzimatica. Tale traslocazione è stata spesso assaggiata dal legame dell’estere di phorbol; gli esteri di phorbol sono agenti che promuovono il tumore che si legano selettivamente e attivano PKC. Recentemente, è stata risolta la base molecolare della traslocazione di PKC dal citoplasma alla membrana plasmatica. La PKC attivata, ma non la forma inattiva dell’enzima, si lega con alta affinità a una serie di proteine associate alla membrana, chiamate recettori per la chinasi C attivata (RACK) . I rack funzionano quindi per analogia con gli AKAP per PKA per dirigere o reclutare questi enzimi ampiamente espressi in siti subcellulari dove è richiesta la loro attività.
Diverse azioni dei segnali extracellulari sono mediate da seconde protein chinasi dipendenti dal messaggero. L’applicazione intracellulare mediante microiniezione o trasfezione di PKA, PKG, CaMK II o PKC in particolari tipi di neuroni ha dimostrato di imitare specifiche risposte fisiologiche (regolazione dei canali ionici, rilascio di neurotrasmettitori e trascrizione genica) a specifici primi messaggeri (neurotrasmettitori o impulsi nervosi) per quei neuroni . Laddove sono disponibili inibitori specifici delle chinasi, la loro applicazione ha dimostrato di bloccare la capacità dei neurotrasmettitori di suscitare tali risposte. Presi insieme, questi risultati dimostrano che l’attivazione di queste seconde protein chinasi dipendenti dal messaggero è sia un passo necessario che sufficiente nella sequenza di eventi con cui alcuni primi messaggeri producono alcuni dei loro effetti fisiologici.
Le metodologie transgeniche hanno fornito ulteriori prove dell’importanza delle proteine chinasi dipendenti dal secondo messaggero nella regolazione della trasduzione del segnale cerebrale. Il miglior esempio fino ad oggi è fornito da topi privi di subunità di CaMK II. Questi animali mostrano carenze in una forma di plasticità sinaptica, potenziamento a lungo termine, nell’ippocampo e apprendimento spaziale anormale, una forma di apprendimento dipendente dalla funzione ippocampale (vedi anche Cap. 50).
