Metodi di purificazione delle proteine: 4 metodi

Questo articolo getta luce sui quattro metodi di purificazione delle proteine.

I quattro metodi di purificazione delle proteine sono: (1) Estrazione (2) Precipitazione e solubilizzazione differenziale (3) Ultracentrifugazione e (4)Metodi cromatografici.

I metodi utilizzati nella purificazione delle proteine, possono essere suddivisi approssimativamente in metodi analitici e preparativi.

La distinzione non è esatta, ma il fattore decisivo è la quantità di proteine, che può essere praticamente purificata con quel metodo. I metodi analitici mirano a rilevare e identificare una proteina in una miscela, mentre i metodi preparativi mirano a produrre grandi quantità di proteine per altri scopi, come la biologia strutturale o l’uso industriale. In generale, i metodi preparativi possono essere utilizzati in applicazioni analitiche, ma non il contrario.

Metodo # 1. Estrazione:

A seconda della fonte, la proteina deve essere portata in soluzione rompendo il tessuto o le cellule che la contengono. Esistono diversi metodi per raggiungere questo obiettivo; Congelamento e scongelamento ripetuti, sonicazione, omogeneizzazione ad alta pressione o permeabilizzazione da solventi organici. Il metodo di scelta dipende da quanto sia fragile la proteina e quanto siano robuste le cellule.

Dopo questo processo di estrazione la proteina solubile sarà nel solvente e può essere separata dalle membrane cellulari, dal DNA,ecc. per centrifugazione. Il processo di estrazione estrae anche le proteasi, che inizieranno a digerire le proteine nella soluzione. Se la proteina è sensibile alla proteolisi, di solito è preferibile procedere rapidamente e mantenere l’estratto raffreddato, per rallentare la proteolisi.

Metodo # 2. Precipitazione e solubilizzazione differenziale:

Nella purificazione delle proteine sfuse, un primo passo comune per isolare le proteine è la precipitazione con solfato di ammonio (NH4)2SO4. Questo viene eseguito aggiungendo quantità crescenti di solfato di ammonio e raccogliendo le diverse frazioni di proteina precipitata. Un vantaggio di questo metodo è che può essere eseguito a buon mercato con volumi molto grandi.

Le prime proteine da purificare sono proteine idrosolubili. La purificazione delle proteine di membrana integrali richiede l’interruzione della membrana cellulare al fine di isolare una particolare proteina da altre che si trovano nello stesso compartimento della membrana. A volte una particolare trazione della membrana può essere isolata per prima, come isolare i mitocondri dalle cellule prima di purificare una proteina situata in una membrana mitocondriale.

Un detergente come il sodio dodecil solfato (SDS) può essere utilizzato per sciogliere le membrane cellulari e mantenere le proteine di membrana in soluzione durante la purificazione; tuttavia, poiché SDS causa denaturazione, detergenti più delicati come Triton X-100 o CHAPS possono essere utilizzati per mantenere la conformazione nativa della proteina durante la purificazione.

Metodo # 3. Ultracentrifugazione:

La centrifugazione è un processo che utilizza la forza centrifuga per separare miscele di particelle di masse o densità variabili sospese in un liquido. Quando un recipiente (tipicamente un tubo o una bottiglia) contenente una miscela di proteine o altre particelle, come le cellule batteriche, viene ruotato ad alta velocità, il momento angolare produce una forza verso l’esterno per ogni particella che è proporzionale alla sua massa.

La tendenza di una determinata particella a muoversi attraverso il liquido a causa di questa forza è compensata dalla resistenza che il liquido esercita sulla particella. L’effetto netto della ” filatura “del campione in una centrifuga è che le particelle massicce, piccole e dense si muovono verso l’esterno più velocemente delle particelle meno massicce o delle particelle con più” resistenza ” nel liquido.

Quando le sospensioni di particelle sono “filate” in una centrifuga, un “pellet” può formarsi sul fondo del recipiente che viene arricchito per le particelle più massicce con bassa resistenza nel liquido. Le restanti particelle non compattate che rimangono ancora per lo più nel liquido sono chiamate “supernatanti” e possono essere rimosse dal recipiente per separare il supernatante dal pellet.

La velocità di centrifugazione è specificata dall’accelerazione angolare applicata al campione, tipicamente misurata rispetto al g. Se i campioni vengono centrifugati abbastanza a lungo, le particelle nel recipiente raggiungeranno l’equilibrio in cui le particelle si accumulano specificamente in un punto del recipiente in cui la loro densità di galleggiamento è bilanciata con la forza centrifuga. Tale centrifugazione “di equilibrio” può consentire un’ampia purificazione di una determinata particella.

Centrifugazione a gradiente di saccarosio:

Un gradiente di concentrazione lineare di zucchero (tipicamente glicerolo di saccarosio, o Percoll) viene generato in un tubo in modo tale che la concentrazione più alta sia sul fondo e più bassa sulla parte superiore. Un campione di proteine viene quindi stratificato sulla parte superiore del gradiente e filato ad alta velocità in un ultracentrifugo. Ciò induce le macromolecole pesanti a migrare verso il fondo del tubo più velocemente del materiale più leggero.

Durante la centrifugazione in assenza di saccarosio, quando le particelle si spostano sempre più lontano dal centro di rotazione, subiscono sempre più forza centrifuga (più si muovono, più velocemente si muovono). Il problema è che l’intervallo di separazione utile all’interno della nave è limitato a una piccola finestra osservabile.

Girare un campione due volte più a lungo non significa che la particella di interesse andrà due volte più lontano; infatti, andrà significativamente più lontano. Tuttavia, quando le proteine si muovono attraverso un gradiente di saccarosio, incontrano liquido di crescente densità e viscosità.

Un gradiente di saccarosio correttamente progettato neutralizzerà la crescente forza centrifuga, quindi le particelle si muovono in stretta proporzione al tempo in cui sono state nel campo centrifugo. I campioni separati da questi gradienti sono indicati come centrifughe “a velocità zonale”. Dopo aver separato la proteina / particelle, il gradiente viene quindi frazionato e raccolto.

Metodo # 4. Metodi cromatografici:

Di solito un protocollo di purificazione delle proteine contiene uno o più passaggi cromatografici. La procedura di base in cromatografia consiste nel far scorrere la soluzione contenente la proteina attraverso una colonna imballata con vari materiali. Diverse proteine interagiscono in modo diverso con il materiale della colonna e possono quindi essere separate dal tempo necessario per passare la colonna o dalle condizioni necessarie per eluire la proteina dalla colonna. Di solito le proteine vengono rilevate mentre si staccano dalla colonna per la loro assorbanza a 280 nm.

Esistono diversi metodi cromatografici:

1. Cromatografia di esclusione di dimensione:

La cromatografia può essere usata per separare la proteina nelle circostanze della denaturazione o della soluzione usando i gel porosi. Questa tecnica è conosciuta come cromatografia di esclusione di dimensione. Il principio è che le molecole più piccole devono attraversare un volume più grande in una matrice porosa. Di conseguenza, le proteine di un certo intervallo di dimensioni richiedono un volume variabile di eluante (solvente) prima di essere raccolte all’altra estremità della colonna di gel.

Nel contesto della purificazione delle proteine, l’eluante viene solitamente raggruppato in diverse provette. Tutte le provette che non contengono tracce misurabili della proteina da purificare vengono scartate. La soluzione rimanente è quindi costituita dalla proteina per purificare e da qualsiasi altra proteina di dimensioni simili.

2. Cromatografia a scambio ionico:

La cromatografia a scambio ionico separa i composti in base alla natura e al grado della loro carica ionica. La colonna da utilizzare viene selezionata in base al tipo e alla forza di carica. Le resine a scambio anionico hanno una carica positiva e sono utilizzate per trattenere e separare i composti caricati negativamente, mentre le resine a scambio cationico hanno una carica negativa e sono utilizzate per separare le molecole caricate positivamente.

Prima che inizi la separazione, un tampone viene pompato attraverso la colonna per equilibrare gli ioni carichi opposti. Dopo l’iniezione del campione, le molecole di soluto si scambieranno con gli ioni tampone mentre ciascuna compete per i siti di legame sulla resina. La lunghezza di ritenzione per ogni soluto dipende dalla forza della sua carica.

I composti più debolmente caricati elutteranno per primi, seguiti da quelli con cariche successivamente più forti. A causa della natura del meccanismo di separazione, il pH, il tipo di buffer, la concentrazione del buffer e la temperatura svolgono tutti ruoli importanti nel controllo della separazione. La cromatografia a scambio ionico è uno strumento molto potente per l’uso nella purificazione delle proteine ed è frequentemente utilizzata nelle separazioni analitiche e preparative.

3. Cromatografia di affinità:

La cromatografia di affinità è una tecnica di separazione basata sulla conformazione molecolare, che utilizza frequentemente resine specifiche per applicazione. Queste resine hanno leganti attaccati alle loro superfici che sono specifici per i composti da separare. Più frequentemente, questi ligandi funzionano in modo simile a quello delle interazioni anticorpo-antigene. Questa” serratura e chiave ” misura fra il legante ed il suo composto dell’obiettivo lo rende altamente specifico, generante frequentemente un singolo picco, mentre tutto il resto nel campione non è mantenuto.

Molte proteine di membrana sono glicoproteine e possono essere purificate mediante cromatografia ad affinità di lectina. Le proteine solubilizzate detergenti possono legarsi a una resina cromatografica che è stata modificata per avere una lectina attaccata in modo covalente.

Le proteine che non si legano alla lectina vengono lavate via e quindi le glicoproteine specificamente legate possono essere eluite aggiungendo un’alta concentrazione di uno zucchero che compete con le glicoproteine legate nel sito di legame della lectina. Alcune lectine hanno un legame ad alta affinità con gli oligosaccaridi delle glicoproteine che è difficile competere con gli zuccheri e le glicoproteine legate devono essere rilasciate denaturando la lectina.

4. Legame del metallo:

Una tecnica comune comprende l’ingegneria una sequenza di 6-8 istidine nel C-terminale della proteina. La poliistidina si lega fortemente agli ioni metallici bivalenti come nichel e cobalto. La proteina può essere passata attraverso una colonna contenente ioni di nichel immobilizzati, che lega il tag di poliistidina. Tutte le proteine non etichettate passano attraverso la colonna.

La proteina può essere eluita con imidazolo, che compete con il tag poliistidina per il legame alla colonna, o da una diminuzione del pH (tipicamente a 4,5), che diminuisce l’affinità del tag per la resina. Mentre questa procedura è generalmente utilizzata per la purificazione di proteine ricombinanti con un tag di affinità ingegnerizzato (come un tag 6xHis o il tag HAT di Clontech), può anche essere utilizzata per proteine naturali con un’affinità intrinseca ai cationi bivalenti.

5. Cromatografia di immunoaffinità:

La cromatografia Immunoaffinity utilizza il legame specifico di un anticorpo alla proteina bersaglio per purificare selettivamente la proteina. La procedura prevede l’immobilizzazione di un anticorpo a un materiale della colonna, che quindi lega selettivamente la proteina, mentre tutto il resto scorre attraverso. La proteina può Ix eluito modificando il pH o la salinità. Poiché questo metodo non comporta l’ingegneria in un tag, può essere utilizzato per proteine da fonti naturali.

6. HPLC:

La cromatografia liquida ad alte prestazioni o la cromatografia liquida ad alta pressione è una forma di cromatografia che applica un’alta pressione per guidare i soluti attraverso la colonna più velocemente. Ciò significa che la diffusione è limitata e la risoluzione è migliorata. La forma più comune è HPLC “a fase inversa”, in cui il materiale della colonna è idrofobo.

Le proteine sono elutate da un gradiente di quantità crescenti di un solvente organico, come l’acetonitrile. Le proteine eluiscono secondo la loro idrofobicità. Dopo la purificazione da HPLC la proteina è in una soluzione che contiene solo composti volatili e può essere facilmente liofilizzata. La purificazione dell’HPLC provoca spesso la denaturazione delle proteine purificate e quindi non è applicabile alle proteine che non si ripiegano spontaneamente.