Negativo selezione dipendente dalla frequenza contribuisce al mantenimento di una globale polimorfismo del DNA mitocondriale

Costruzione del Mito-nucleare linee di introgressione

Per isolare gli effetti genetici del dna mitocondriale dal genoma nucleare, i nostri esperimenti sono stati basati su mitonuclear linee di introgressione (MNILs). La costruzione dei nostri MNILs è spiegata in dettaglio in Kurbalija Novicic et al. . In breve, tutti i MNIL utilizzati sono stati creati da linee isofemali (IFLs), ognuna delle quali è stata fondata da una singola femmina accoppiata raccolta in natura proveniente da una singola popolazione naturale comune (Gola di Sicevo-Serbia, S 43°19’55.58″ N 22°0837.98″). Le linee sono state prima genotipizzate per il loro aplotipo mtDNA usando enzimi di restrizione e abbiamo selezionato sei IFL, tre dei quali portavano aplotipi HI e tre aplotipi HII, ognuno dei quali è stato poi incrociato con un settimo IFL comune (“D”). In ogni MNIL, backcrossing è stata eseguita accoppiando 10 femmine vergini da un dato IFL con 20 maschi dalla linea D. Abbiamo usato questa procedura introgressiva ripetuta backcrossing per 12 generazioni successive per sostituire il genoma nucleare di un dato IFL con il genoma nucleare D outbred comune (> 99.95% sostituito). Si noti che IFLs non erano inbred o altrimenti reso isogenico. Per escludere la possibilità di contaminazione durante l’introgressione, l’integrità del mtDNA di tutti gli MNIL è stata convalidata alla generazione 5, 8 e 12 genotipizzando un campione di mosche da ciascun MNIL. Abbiamo anche testato per la presenza di Wolbachia in tutti i MNILs, da un test PCR utilizzando 16S rDNA Wolbachia-primer specifici utilizzando metodi dettagliati in García-Martínez et al. . Abbiamo usato due diversi ceppi di Drosophila contenenti Wolbachia come controlli positivi (D. melanogaster stock no. 5, Bloomington Stock Centre, D. simulans, Riverside strain). Questi saggi di PCR erano negativi per tutti i nostri MNILs e per la linea D. Tutte le linee sono state mantenute e tutti gli esperimenti eseguiti in condizioni di laboratorio costanti, a 19 °C, 60% di umidità relativa, luce di 300 lx e ad un fotoperiodo di 12 h luce: 12 h buio.

Fondazione delle popolazioni di evoluzione sperimentale

Prima degli esperimenti, abbiamo amalgamato i tre MNIL che trasportano HI in una popolazione sorgente HI e i tre MNIL HII in una popolazione sorgente HII per omogeneizzare la potenziale variazione genetica nucleare tra MNILs. Questo è stato fatto mescolando 100 mosche adulte da ogni MNIL, in due gabbie di popolazione (cioè, N = 3 × 100 mosche per gabbia) (Gabbie in plexiglas, L25 cm x L15 cm x 15 cm, con 3 piatti contenenti ciascuno 30 ml di farina di mais) e mantenendole per una successiva generazione completa in condizioni standard di laboratorio. Le due popolazioni di origine, quindi, portavano l’aplotipo HI o HII mtDNA, espresso in un background genetico nucleare comune e comune (cioè, D). Le mosche vergini di queste due popolazioni di origine sono state poi sessuate e utilizzate per fondare le popolazioni di evoluzione sperimentale.

Abbiamo avviato N = 12 popolazioni di evoluzione sperimentale. In ogni popolazione, N = 100 mosche vergini (rapporto sessuale 1:1) di età compresa tra 3 e 5 giorni sono state introdotte dalle popolazioni di origine in una gabbia di popolazione (L25 cm x L15 cm x 15 cm). Abbiamo variato la frequenza iniziale degli aplotipi HI e HII e le condizioni delle risorse alimentari tra le popolazioni, utilizzando un design incrociato 2 × 2 (N = 3 popolazioni per cellula), nel modo seguente. Nella metà delle gabbie, l ‘ 80% delle mosche fondatrici proveniva dalla popolazione di origine HI e il 20% dalla popolazione di origine HII. Nell’altra metà, il 20% delle mosche fondatrici proveniva dalla popolazione di origine HI e l ‘ 80% dalla popolazione di origine HII. In termini di condizioni delle risorse alimentari, la quantità di mezzo (sia in volume che in superficie) era identica nei due gruppi di trattamento, mentre all’interno della popolazione la variazione della concentrazione dei nutrienti è stata manipolata come segue. La metà delle gabbie (condizioni alimentari omogenee) conteneva 3 piatti di cibo identici, ciascuno con 30 ml di mezzo standard di farina di mais (YC) contenente 1,5% di lievito. L’altra metà delle gabbie (condizioni alimentari eterogenee) conteneva anche 3 piatti ciascuno con un mezzo standard da 30 ml, ma questi differivano per la concentrazione di lievito (YL-0,375%, YC – 1,5%, YH – 6%).

Mantenimento dell’evoluzione sperimentale popolazioni

Le popolazioni sono state mantenute in laboratorio in modo da garantire generazioni discrete, 40 giorni/ciclo , a 19 °C, 60% di umidità relativa e un ciclo di 12 ore luce: 12 ore buio. Al giorno 40, i tre vecchi piatti di cibo sono stati sostituiti da tre nuovi e le mosche sono state consentite in totale 9 giorni per la deposizione delle uova . I nuovi piatti, contenenti uova e larve, sono stati quindi eliminati da qualsiasi adulto e trasferiti in una nuova gabbia per iniziare la generazione successiva. Tutte le mosche adulte in ogni vecchia gabbia venivano poi contate, una volta morte.

Assiemi di sequenziamento e mitogenoma

Prima della stima della frequenza dell’aplotipo (vedi sotto), abbiamo sequenziato e assemblato tutti gli aplotipi mtDNA utilizzati. Il DNA è stato estratto dalle sei linee IF (HI: 1, 3, 5; HII: 21, 25, 29) utilizzate per creare il MNILs, utilizzando un protocollo di precipitazione sale-etanolo. Le mosche sono state prima macerate delicatamente e poste in tampone di preparazione (100 mm NaCl, 10 mM Tris-HCl, pH = 8.0, 0.5% SDS) insieme alla proteinasi K, vortexate e incubate a 50 °C durante la notte. I campioni sono stati poi congelati durante la notte. Per precipitare il DNA, abbiamo aggiunto NaCl saturo diverse volte prima di aggiungere etanolo al 95% e abbiamo filato il DNA in un pellet. Il pellet di DNA è stato sospeso nel tampone TE 4 (pH = 7,6). La qualità e la quantità del DNA sono state valutate utilizzando NanoDrop, Qubit e Bioanalyzer, seguiti dalla valutazione della lunghezza del frammento su un gel di agarosio.

Le librerie di sequenziamento sono state preparate da 100 ng di DNA utilizzando il TruSeq PCRfree DNA library preparation kit. I sei campioni sono stati poi sequenziati a 125 bp accoppiati-end legge in due corsie su un sistema Illumina HiSeq2500 utilizzando v4 chimica sequenziamento. In totale, abbiamo sequenziato in media 194 milioni di letture per ogni libreria. I mitogenomi dei sei campioni sono stati quindi assemblati utilizzando un sottoinsieme del 5% del numero totale di letture da ciascuna libreria. Le letture sono state alimentate con l’algoritmo MITObim V 1.8 e MIRA V 4.0.2 assemblatore, per eseguire assiemi guidati, utilizzando il Drosophila pseudoobscura mitogenome (GenBank: FJ899745. 1) come genoma di riferimento. Tutti gli assiemi ottenuti erano mitogenomi circolari con una dimensione di quasi 16kbp. Gli assiemi finali sono stati quindi allineati utilizzando ClustalW e MAFFT e curati manualmente per ottenere un assemblaggio finale lucidato per ogni aplotipo. I mitogenomi assemblati sono stati annotati usando DOGMA e MITOS, usando le impostazioni predefinite dei parametri e infine curati manualmente.

Per valutare la validità del nostro assemblaggio di mitogenomi, tutte le sequenze mtDNA di Drosophila subobscura disponibili su GenBank (Cox1, Cox2, Cox3, Cob, Nad1, Nad2, Nad3, Nad5, rrnL, rrnS, la regione ricca di A + T e diversi trna), in totale coprendo più del 50% dell’assemblaggio totale, sono state allineate contro i nostri mitogenomi. Senza eccezioni, questi hanno mostrato un’identità di sequenza > 99%.

Diversi SNP unici sono stati trovati in ciascuno dei sei aplotipi mitogenomici (vedi sotto), di cui due distinguevano coerentemente i gruppi di aplotipi HI e HII. La profondità di copertura per ogni SNP è stata verificata mappando le letture utilizzate per l’assemblaggio del mitogenoma utilizzando Bowtie v 1.2 . Questi sforzi hanno confermato tutti gli SNP identificati nella fase di assemblaggio. Qui, ci concentriamo sui due principali gruppi aplotipici I e II, che mostrano un modello sorprendente e coerente di polimorfismo all’interno della popolazione tra le popolazioni (Fig. 1) e differenze fenotipiche funzionali (vedi Introduzione). Sebbene gli SNP si verifichino all’interno di ciascuno dei due gruppi aplotipici, tali SNP sono rari (ad esempio ) e non sono costantemente polimorfici.

Stima delle frequenze aplotipiche mtDNA

Abbiamo usato pool-seq per stimare l’evoluzione della frequenza aplotipica, sequenziando campioni di mosche dalla 5a e 10a generazione di ogni popolazione di evoluzione sperimentale. In ciascun campione, 105 mosche selezionate casualmente per gabbia sono state raggruppate e sottoposte all’estrazione del DNA (in gruppi di 15) e ai preparati della libreria di sequenziamento come descritto sopra. I campioni N = 24 sono stati quindi sequenziati a 125 bp accoppiati-end in due corsie su un sistema Illumina HiSeq2500, utilizzando la chimica di sequenziamento v4. Il nostro sforzo pool-seq è stato progettato per fornire sufficiente profondità di sequenziamento per una stima accurata delle frequenze aplotipo mtDNA, ma non consente analisi dettagliate del genoma nucleare.

Abbiamo sequenziato, in media, 66 milioni di letture per ogni libreria. Le letture da ogni libreria sono state quindi mappate ai sei mitogenomi assemblati, mantenendo solo mappature uniche e zero-mismatch usando Bowtie v 1.2 . Il numero di letture mappate ai due SNP che distinguevano i tipi HI e HII (in Nad5 e in 12S rRNA) sono stati quindi contati e utilizzati come stima della frequenza relativa di ciascun aplotipo principale (HI o HII) in ciascun campione.

Analisi statistiche

Per ogni campione, tutte le letture mappate ai due SNP diagnostici (vedi sotto) sono state contate come di tipo HI o di tipo HII. La proporzione di letture HI per i due diversi SNP era strettamente correlata tra i 24 campioni (r = 0,987), in modo tale che entrambi i marcatori fornissero stime praticamente identiche. Qui, abbiamo usato la proporzione media tra entrambi gli SNP qui per stimare la frequenza di HI presente in ogni campione pool-seq.

L’evoluzione può essere definita come cambiamenti nelle frequenze di genotipo all’interno di una popolazione, e il nostro design ci ha permesso di ricavare due misure ripetute temporalmente separate di variazioni di frequenza di aplotipo per generazione in ogni nostra linea in evoluzione come Δf0–5 = (f5 – f0)/5 o Δf5–10 = (f10 – f5)/5 Inoltre, abbiamo stimato Δf0 – 10 = (f10-f0)/10 per valutare il cambiamento di frequenza dell’aplotipo netto. Perché sono stati coinvolti solo due genotipi, la frequenza di HI: fI = 1-fII, e quindi limitiamo le nostre analisi ai cambiamenti nella frequenza di uno degli aplotipi. Per ogni stima di Δf, abbiamo anche derivato un coefficiente di selezione dipendente dalla frequenza (SI) corrispondente alla forza di selezione richiesta per causare il cambiamento osservato nelle frequenze dell’aplotipo (vedi sotto).

Ogni linea in evoluzione rappresenta un’unità osservativa nel nostro progetto, e quindi abbiamo analizzato i nostri dati utilizzando misure ripetute ANOVA (cioè ANOVA all’interno dei soggetti). Qui, ogni riga rappresenta il soggetto, e la frequenza iniziale di HI (0.2 o 0.8) e la condizione ambientale (omogenea o eterogenea) erano due fattori tra soggetti, e le due misure ripetute (di Δf o SI) prese a diversi intervalli generazionali erano trattate come un fattore all’interno dei soggetti. In queste analisi, i fattori focali tra soggetti testano gli effetti dei nostri trattamenti sperimentali e i fattori all’interno dei soggetti testano se il modello di evoluzione è cambiato nel corso del nostro esperimento. Questa strategia analitica si basa sul fatto che tracciamo le dinamiche di frequenza in linee replicate e indipendenti e l’effetto non focale della deriva genetica casuale, che si prevede sia sostanziale per le dinamiche mtDNA, fa parte del termine residuo dei nostri modelli inferenziali. I test F convenzionali dei fattori tra soggetti sono stati convalidati utilizzando test di permutazione, basati su 9999 permutazioni casuali di dati. La SI media per diversi gruppi è stata valutata utilizzando il 95% di CI da 9999 repliche di bootstrap di dati.

Stime della forza della selezione dipendente dalla frequenza

Abbiamo anche voluto valutare in modo più esplicito se la forza della selezione dipendente dalla frequenza su HI e HII differisse tra i due trattamenti sperimentali ambientali (omogeneo / eterogeneo). Per consentire ciò, abbiamo derivato semplici misure di selezione dipendente dalla frequenza dai nostri dati empirici utilizzando la seguente logica. Precedenti modelli espliciti di dati non sperimentali in questo sistema hanno dimostrato che la migliore corrispondenza con i dati dinamici di frequenza dell’aplotipo si verifica quando non c’è selezione positiva o negativa su questi aplotipi mtDNA ma dove c’è una selezione dipendente dalla frequenza negativa che è ugualmente forte su entrambi gli aplotipi . Consideriamo i due aplotipi mtDNA HI e HII, con le frequenze pI e pII (pI + pII = 1) e fitnesses WI e WII. La variazione per generazione in pI è quindi data da

Osservazioni da entrambe le popolazioni naturali (vedi Fig. 1; File aggiuntivo 1) e le popolazioni di gabbie di laboratorio replicate suggeriscono anche che la selezione è simmetrica con un equilibrio per i due aplotipi HI e HII in prossimità di pI = pII = 0.5. Assumendo (i) una frequenza di equilibrio di pI = pII = 0.5, (ii) che l’aplotipo di fitness è linearmente correlata alla frequenza aplotipo e (iii) che la selezione è simmetrica, che sono supportati da studi precedenti , otteniamo

dove sI trova la frequenza dipendente dal coefficiente di selezione. Dato che \( \overline{W}={p}_I{W}_I+{p}_{II}{W}_{II} \), si può quindi stimare sI, le nostre osservazioni empiriche ΔpI come

Definito in questo modo, sI assume una scala arbitraria, ma è positivo quando di ΔpI cambiamenti verso l’attrattore e negativo quando si cambia lontano da attrattore. Per ogni gabbia, abbiamo stimato due misure ripetute indipendenti di sI basate sulle variazioni di frequenza dell’aplotipo osservate tra le generazioni 0-5 e 5-10, rispettivamente. Notiamo che la nostra misura sarà precisa quando il vero equilibrio è vicino a pI = pII = 0.5 ma più approssimativo se il vero equilibrio si discosta da questa condizione.