Neuraminidasi È Importante per l’inizio di Infezione da Virus dell’Influenza Umana Epitelio delle vie Aeree

Si ritiene che la funzione principale della neuraminidasi virale (NA) sia nella fase finale dell’infezione quando NA scinde l’acido sialico dalla superficie cellulare e dai virioni della progenie facilitando il rilascio di virus dalle cellule infette (1, 2). Meno si sa sulle funzioni NA durante l’ingresso del virus nella cellula. È stato a lungo ipotizzato che NA promuova l’accesso del virus alle cellule bersaglio nelle vie aeree mediante la degradazione del muco (3). Tuttavia, questo concetto non è mai stato formalmente dimostrato a causa della mancanza di un adeguato sistema sperimentale. Inoltre, sono state riportate alcune prove che contestano il ruolo della NA nelle prime fasi dell’infezione (esaminate nel riferimento 2).

Per affrontare questo problema, abbiamo studiato gli effetti dell’inibitore NA oseltamivir carbossilato (OC) (9) sull’ingresso del virus dell’influenza nelle colture dell’epitelio delle vie aeree umane. Le cellule epiteliali tracheobronchiali umane primarie (HTBE; Clonetica) e le cellule epiteliali nasali primarie (PromoCell GmbH) sono state coltivate su supporti a membrana (12 mm Transwell-Clear; Corning, Inc.) all’interfaccia aria-liquido in fattore di crescita senza siero e mezzo integrato con ormoni (6, 8). Per tutti gli esperimenti sono state utilizzate colture completamente differenziate da 4 a 8 settimane. Queste colture erano pseudostratificate e polarizzate; contenevano cellule basali, ciliate e secernenti muco; e assomigliavano strettamente all’epitelio delle vie aeree umane in vivo (Fig. 1). OC (1 µM, se non indicato diversamente) è stato aggiunto alle sospensioni virali e ai compartimenti basolaterali delle colture poco prima di infettare due colture replicate dal lato apicale. Due colture di controllo sono state infettate in assenza di inibitore. Un’ora dopo l’infezione, abbiamo rimosso l’inoculo del virus e incubato le colture all’interfaccia aria-liquido per ulteriori 6 ore per consentire la replicazione intracellulare del virus. Le colture sono state quindi fissate e le cellule infette sono state identificate colorando con antisieri policlonali a virus interi seguiti da corrispondenti anticorpi secondari marcati con perossidasi (Dianova) e substrato di aminoetilcarbazolo (Sigma). La colorazione positiva ha indicato il successo dell’ingresso del virus nella cellula. Le colture sono state analizzate en faccia ad un ingrandimento di ×300 (Olympus IMT-2). Un numero totale di cellule che esprimono l’antigene virale è stato contato nel segmento epiteliale che includeva tutte le viste microscopiche consecutive (0,28 per 0,42 mm) lungo il diametro della coltura (superficie del segmento, 3 mm2; numero di cellule per segmento, circa 30.000). Quattro segmenti per coltura sono stati contati ruotando la coltura in senso orario di 45o. I dati per otto segmenti di due colture replicate sono stati calcolati in media.

In due esperimenti con colture HTBE, il virus umano A/Memphis/14/96 (H1N1) ha infettato 22 e 65 volte meno cellule in presenza di inibitore NA rispetto ai controlli (Fig. 2; Tabella 1) (P < 0,0001). Anche i virus A / Duck / Alberta/119/98 (H1N1) di un uccello acquatico selvatico e A/Turkey/Italy / 2379 / 99 (H7N1) di pollame domestico erano marcatamente sensibili all’OC in queste colture. Nelle colture epiteliali nasali, OC ha ridotto l’infezione da virus umano e anatra 120-e 520-fold, rispettivamente. Questi risultati hanno indicato che l’inibizione della NA virale sopprime l’inizio dell’infezione da virus.

A/Chicken/Germany/R28/03 (H7N7) appartiene al lignaggio del virus dell’influenza aviaria ad alta patogenicità che ha causato il focolaio di peste negli allevamenti di pollame commerciali nei Paesi Bassi, in Belgio e in Germania nel 2003. Questi virus sono stati trasmessi ad almeno 89 esseri umani, la maggior parte dei quali presentavano congiuntivite, ma si è verificato anche un caso fatale di polmonite (5). L’infezione da virus di pollo H7N7 nelle colture HTBE è diminuita di 140 e 40 volte in presenza di 1 e 0,1 µM OC, rispettivamente. Queste concentrazioni rappresentavano le tipiche concentrazioni plasmatiche massime e minime di farmaco raggiunte nell’uomo dopo somministrazione di 75 mg di oseltamivir fosfato, la dose raccomandata per la profilassi (9).

Per confermare l’ipotesi che l’inibizione dell’infezione nei nostri esperimenti fosse direttamente correlata all’inibizione dell’attività enzimatica NA virale, abbiamo usato Human A/Sydney/5/97-come il virus (H3N2) e il suo mutante resistente agli oseltamivir con una sostituzione R292K nel NA, che rende il NA 9.000 volte meno sensibile all’inibizione da OC (4). Coerentemente con l’ipotesi, il virus umano genitore è stato fortemente inibito da OC, mentre solo un livello marginale di inibizione del mutante resistente è stato osservato quando entrambi i virus sono stati testati nello stesso esperimento in colture HTBE (Tabella 1). Fino ad ora, non era disponibile un adeguato test di coltura cellulare per monitorare la resistenza del virus influenzale agli inibitori della NA a causa della mancata corrispondenza tra i recettori dell’acido sialico nell’uomo e nelle linee cellulari di laboratorio convenzionali (9, 11). I nostri risultati suggeriscono che colture differenziate di epitelio delle vie aeree umane possono essere un sistema di coltura cellulare adatto per il rilevamento della resistenza del virus influenzale agli inibitori della NA.

Infine, utilizzando il farmaco-sensibile A/Sydney/5/97-come il virus, abbiamo testato l’inibizione dell’infezione da OC aggiunto in momenti diversi dopo l’inoculazione del virus. Mentre 47 volte meno cellule sono state infettate quando il farmaco è stato aggiunto poco prima dell’infezione, un ritardo di 1 ora in aggiunta a OC ha provocato solo un’inibizione di 1,5 volte rispetto al controllo non trattato (Tabella 1). Se il farmaco è stato aggiunto 4 h dopo l’inoculazione del virus, non è stata osservata alcuna inibizione statisticamente significativa. Questi dati hanno suggerito che l’OC ha influenzato le prime fasi dell’infezione che precedono la replicazione del virus.

In sintesi, abbiamo fornito qui per la prima volta prove sperimentali dirette per il ruolo essenziale di NA nella fase di invasione virale dell’epitelio ciliato delle vie aeree umane. La funzione NA in questa fase è la rimozione più probabile dei recettori decoy su mucine, ciglia e glicocalix cellulare, forte legame a ciascuno dei quali impedirebbe l’accesso del virus ai recettori funzionali sulla membrana superficiale delle cellule bersaglio. Tuttavia, altre funzioni NA-per esempio, la promozione della fusione mediata dall’emoagglutinina (7)—non possono essere escluse, e sono necessari ulteriori studi per specificare i meccanismi esatti con cui NA promuove l’ingresso del virus nelle cellule epiteliali delle vie aeree.

Non essendo ancora disponibile alcun vaccino contro i virus dell’influenza aviaria ad alta patogenicità H7N7 e H5N1, i farmaci antivirali rimangono l’unica opzione per combattere l’influenza aviaria (10). Rispetto ad altri agenti anti-influenzali, gli inibitori NA sono ben tollerati ed efficaci contro tutti i ceppi di virus influenzali A e B. Ci sono state poche prove dell’emergere di resistenza virale e l’infettività dei virus mutanti è solitamente compromessa (9, 11). La capacità degli inibitori della NA di sopprimere l’infezione prima dell’ingresso del virus nelle cellule sottolinea il loro alto potenziale di misure preventive. In particolare, i nostri dati forniscono la base scientifica per supportare l’uso profilattico di questi composti per le persone ad alto rischio di infezione da virus dell’influenza aviaria.