Breve introduzione: Blotting Techniques
Blotting è utilizzato in biologia molecolare per l’identificazione di proteine e acidi nucleici ed è ampiamente usato per scopi diagnostici. Questa tecnica immobilizza la molecola di interesse su un supporto, che è una membrana nitrocellulosica o nylon. Utilizza tecniche di ibridazione per l’identificazione degli acidi nucleici e dei geni specifici.
La tecnica di blotting è uno strumento utilizzato nell’identificazione di biomolecole quali ad DNA, mRNA e proteine durante le diverse fasi di espressione genica. La sintesi proteica comporta l’espressione di un segmento di DNA che viene convertito in mRNA per produrre la rispettiva proteina.
I sottotipi di blotting come northern, western & southern dipendono dalla molecola target che viene ricercata. Quando una sequenza di DNA è il fondamento o il codice per una molecola proteica, la particolare molecola di DNA di interesse può essere cancellato utilizzando la tecnica Southern Blotting. Durante l’espressione genica, quando il DNA è espresso come mRNA per una produzione di proteine, questo processo può essere identificato mediante Northern blotting. Infine, l’mRNA codificato produce la proteina interessata, questa identificazione proteica può essere effettuata mediante Western Blotting.
Procedura generale per il blotting
- Omogeneizzare il campione.
- Separazione della molecola di interesse da una membrana di elettroforesi.
- Trasferimento delle molecole ad una membrana nitro cellulosica/ membrana di nylon.
- Ibridazione o identificazione della molecola
Northern Blotting
Northern Blotting è una tecnica utilizzata per lo studio dell’espressione genica. Viene fatto rilevando un particolare RNA (o mRNA isolato). L’mRNA è rappresentato generalmente come 5% della sequenza globale del RNA. Questo metodo rivela l’identità, il numero, l’attività e la dimensione del gene particolare. Questa tecnica di blotting può anche essere utilizzata per la crescita di un tessuto o di un organismo. In diverse fasi di differenziazione e morfogenesi l’abbondanza di un RNA cambia e questo può essere identificato utilizzando questa tecnica. Aiuta anche nell’identificazione di condizioni anormali, malate o infette a livello molecolare. La tecnica northern blot è stata sviluppata nel 1977 da James Alwine, David Kemp e George Stank alla Stanford University. La tecnica ha preso il nome a causa della somiglianza del processo con Southern blotting. La differenza principale tra queste due tecniche è che northern blotting riguarda solo l’RNA.
Principio
Come tutte le normali tecniche di blotting, northern blotting inizia con l’elettroforesi per separare i campioni di RNA per dimensione. L’elettroforesi separa le molecole di RNA in base alla carica degli acidi nucleici. La carica negli acidi nucleici è proporzionale alla dimensione della sequenza di acido nucleico. Così la membrana di elettroforesi separa la sequenza dell’acido nucleico secondo la dimensione della sequenza del RNA. Nei casi in cui la nostra sequenza target è un mRNA, il campione può essere isolato attraverso tecniche cromatografiche di cellulosa oligo, poiché gli mRNA sono caratterizzati dalla coda poli(A). Poiché le molecole di gel sono fragili in natura, le sequenze separate vengono trasferite alle membrane di nylon. La selezione della membrana di nylon contribuisce al fattore che gli acidi nucleici sono caricati negativamente in natura. Una volta che le molecole di RNA sono trasferite è immobilizzato dal legame covalente. La sonda viene quindi aggiunta, la sonda può essere complementare una sequenza di DNA ss. La formammide è generalmente utilizzata come tampone assorbente in quanto riduce la temperatura di ricottura.
Procedura
- Il campione di tessuto o di coltura raccolto viene prima omogeneizzato. I campioni possono essere rappresentativi di diversi tipi di cultura per il confronto o può essere per lo studio di diversi stadi di crescita all’interno della cultura.
- La sequenza di RNA viene separata nell’unità di elettroforesi un gel di agarosio viene utilizzato ai fini della separazione dell’acido nucleico.
- Ora la sequenza di RNA separata viene trasferita alla membrana di nylon. Questo viene fatto da due meccanismi di azione capillare e l’interazione ionica.
- L’operazione di trasferimento viene eseguita mantenendo il gel nel seguente ordine. In primo luogo, il gel di agarosio viene posto sul fondo della pila, seguito dalla membrana assorbente. Sopra questi asciugamani di carta viene posizionato un leggero peso (lastra di vetro). L’intera configurazione è conservata in un becher contenente buffer di trasferimento.
- L’RNA trasferito alla membrana di nylon viene quindi fissato utilizzando la radiazione UV.
- La membrana fissa in nylon viene quindi miscelata con le sonde. Le sonde sono specificamente progettate per il gene di interesse, in modo che si ibridino con sequenze di RNA sulla macchia corrispondente alla sequenza di interesse.
- La membrana della macchia viene lavata per rimuovere la sonda indesiderata
- La sonda etichettata viene rilevata mediante chemiluminescenza o autoradiografia. Il risultato sarà bande scure in pellicola a raggi X.
GEl e Sonde
I campioni di RNA vengono separati utilizzando gel di agarosio utilizzando formaldeide come agenti denaturanti, ma in piccole sequenze di RNA o micro RNA possono essere utilizzate anche sequenze di poliacrilammide con urea come agente denaturante. Il bromuro di etidio può essere usato come agente colorante. Due tipi di marcatori sono per la marcatura delle dimensioni. Una scala di RNA e una subunità ribosomiale sono utilizzate per l’identificazione della dimensione delle sequenze di RNA.
Le sonde possono essere complementari all’intero o a parte dell’RNA di interesse. Possono essere RNA, DNA o oligonucleotidi di 25 basi complementari all’RNA bersaglio. Nel caso di sonde a RNA, le sonde prodotte da invitro vengono utilizzate come sonde invivo in grado di denaturare grazie al lavaggio rigoroso. In caso di cDNA, le sonde sono etichettate con isotopi radioattivi, fosfatasi alcalina o perossidasi di rafano in caso di chemiluminescenza.
