Oncology Reports

Introduzione

anche se le nuove terapie hanno recentemente beenintroduced nella pratica clinica per il trattamento di advancedprostate cancro, il cancro alla prostata è rimasto il secondo deadliestcancer negli uomini negli Stati Uniti nel 2014 (1). Nuovi obiettivi e strategie terapeutiche sono urgentemente necessari per migliorare ulteriormente l’esito clinico dei pazienti affetti da cancro alla prostata.

Un promettente potenziale bersaglio terapeutico kiniclina-dipendente chinasi 5 (CDK5). CDK5 è una serina / treonina kinasestructurally simile ad altri CDK (2). CDK5 non sembra avere un majorrole nella regolazione del ciclo cellulare (3,4). È stato ben caratterizzato per il suo ruolo dominante nello sviluppo del sistema nervoso centrale, compresi i ruoli nella migrazione, nella differenziazione e nell’adesione euronali (5,6). Weand altri hanno successivamente dimostrato che CDK5 svolge un ruolo importante dentrosviluppo del cancro e metastasi (7-12). Nelle cellule tumorali prostatiche, abbiamo dimostrato che CDK5 era critico per l’integrità scheletrica, la migrazione e l’invasione cellulare e invivo, per le metastasi (7). Nel cancro pancreatico, CDK5 è intrinseco alla segnalazione KRAS attraverso la via di trasduzione del segnale RAL centralmente importante, fornendo così un potenziale bersaglio “drogabile” per i tumori KRAS mutanti (8). Insieme, questi studi indicano chel’inibizione di CDK5, da solo o in combinazione con altri agenti, puòfornire una strategia terapeutica efficace per questi e altritipi di cancro.

Nel presente studio abbiamo deciso di identificare gli agentiche sarebbe particolarmente efficace in combinazione con CDK5inibizione nelle cellule di cancro alla prostata. Pertanto, abbiamo eseguito comeschermo della Johns Hopkins Drug Library (JHDL). Il JHDL è una raccolta di 3.360 composti farmaceutici che hanno completato con successo i test di sicurezza negli esseri umani per una varietà di applicazioni(13,14). Questa libreria è stata utilizzata con successo per la riproposizione di composti per la terapia del cancro, compresa l’identificazione della digossina come inibitore dell’HIF1a (15) e dell’itraconazolo come inibitore dell’angiogenesi (16). In precedenza abbiamo impiegato il JHDL per identificare il bromuro di cetrimonium e irinotecan comecomposti con maggiore attività antitumorale contro le cellule del cancro alla prostata che esprimono bassi livelli del gene soppressore delle metastasi N-micodownregulated gene 1 (NDRG1) (17).Qui, abbiamo eseguito un simile screening JHDL con carcinoma prostatico che differiscono nell’attività CDK5. Tilorone è stato identificato come un composto con letalità sintetica in vitro Cellule tumorali della prostata carenti di inCDK5.

Materiali e metodi

Coltura cellulare

Le linee cellulari del cancro alla prostata PC3 sono state ottenute DAATCC. Queste cellule sono derivate da una metastasi ossea da un paziente con cancro alla prostata di 62 anni. I fibroblasti della prostata umana, kindlyprovided dal Dr J. Isaacs, sono stati ottenuti da una biopsia della prostata su un paziente di cancro alla prostata di 62 anni con un punteggio Gleason di 4. Le linee Bothcell sono state coltivate e mantenute nei media RPMI-1640 (Invitrogen)integrati con siero bovino fetale al 10%. Le cellule sono state coltivate in un incubatore umidificato a 37°C in un’atmosfera di CO2 al 5%.

Creazione della linea cellulare PC3 CDK5dn

La perdita della funzione CDK5 è stata compiuta nelle cellule PC3 mediante trasfezione di un costrutto dominante-negativo contenente una D144NMUTAZIONE, gentilmente fornita dal dr L. H. Tsai (Harvard Medical School)(18). Il protocollo utilizzato è stato descritto in precedenza (7). In breve, il costrutto è stato subclonato in un vettore Tet bidirezionale, pBI-EGFP(BD Biosciences), che aveva un gene di resistenza alla zeocina aggiunto per la selezione (gentilmente fornito dal Dr K. Schuebel, Johns HopkinsUniversity School of Medicine). Il vettore vuoto pBI-EGFP o il vettore PBI-EGFPCDK5dn è stato trasfettato in cellule PC3 che contenevano un costrutto promotore aTet-Off, pTTa (BD Biosciences).

Western blotting

Western blotting è stato eseguito come descritto in precedenza (19). Dieci microgrammi diproteina sono stati caricati sul gel. Gli anticorpi primari sono stati disciolti inboccante tampone . Una diluizione 1: 1,000 è stata utilizzata per anti-CDK5 (Sigma-Aldrich); l’anti-vinculina (Millipore,Upstate) è stata diluita 1:4,000. Gli anticorpi secondari sono stati diluiti con diluizione ata 1:4.000. La normalizzazione dell’intensità della banda è stata effettuatafuori con la vinculina della proteina governante. Le macchie sviluppate eranocannerizzato utilizzando uno scanner Microtek.

Saggio di guarigione della ferita

I saggi di guarigione della ferita sono stati eseguiti con controllo confluentPC3 (contenente il vettore PBI-EGFP vuoto) o PC3 CDK5dncells. Un raschietto con punta in gomma è stato utilizzato per raschiare un’area dicellule. Immagini microscopiche leggere sono state catturate immediatamente e 24 hafter raschiando.

Screening della libreria di piccole molecole

La libreria JHDL è stata descritta in precedenza(13,14,17).Lo stoccaggio e lo screening dei composti JHDL sono stati effettuati come descritto in precedenza (17).In breve, le celle di controllo PC3 e CDK5dn sono state seminate in piastre da 96 pozzetti (1×103 celle/pozzetto) e lasciate aderire durante la notte. Then5 µl di farmaci, immagazzinati come soluzioni di riserva di 200 µM inDMSO / H2O, è stato aggiunto per completare i media RPMI, in modo da thatcells sono stati trattati ad una concentrazione finale di 10 µM. Dopo 48 ore di trattamento, 20 µl di reagente MTS del test di proliferazione cellulare AqueousNon radioattivo CellTiter 96™ sono stati aggiunti a ciascun pozzetto per una durata di 2-4 ore a 37°C. Le piastre sono state analizzate utilizzando aSoftMax Pro plate reader (Dispositivi molecolari). La proliferazione delle cellule trattate è stata confrontata con la proliferazione delle cellule PC3control o CDK5dn trattate con DMSO (indice di proliferazione). Gli indicatori di proliferazione delle cellule PC3 CDK5dn sono stati confrontati con gli indicatori di proliferazione delle cellule di controllo PC3. È stato condotto uno studio PubMed per valutare l’uso clinico di potenziali hit.

Test MTS

Sono stati eseguiti test MTS per misurare l’effetto antiproliferativo del trattamento con tilorone. Tiloronedihydrochloride (Sigma-Aldrich) è stato immagazzinato come stocksolution 10 mm in DMSO a -20°C. Mille celle PC3 sono state placcate in piastre da 96 pozzetti contenenti 100 µl di supporti RPMI completi. Alla confluenza del 50% circa, è stato somministrato tilorone dicloridrato. Peresperimenti il composto è stato diluito in mezzi RPMI completi per ottenere la concentrazione finale desiderata. Dopo il trattamento per 72 h(tilorone in monoterapia), è stato aggiunto il reagente MTS e l’assorbimento a 490 nm è stato determinato utilizzando un lettore di piastre SoftMax Pro.Sono stati calcolati gli indici di proliferazione; le cellule di controllo PC3 non trattate OCDK5DN (in supporti RPMI completi da 103 µl) sono state utilizzate come acontrol. I test t dello studente sono stati eseguiti per valutare i valori P.

Test clonogenici

Sono stati eseguiti test clonogenici per valutare la sopravvivenza a lungo termine dopo il trattamento con tilorone. Le cellule del cancro alla prostata eranopiatto in piatti da 60 mm e permesso di aderire. Alla confluenza 50-60%, le cellule sono state trattate con tilorone per 72 h. Successivamente, 1×103 cellule da ciascun piatto sono state placcate in triplice copia in piatti da 60 mm e incubate in mezzi RPMI completi per 12 giorni.Le colonie sono state fissate e colorate con una soluzione contenente il 90% di metanolo e il 10% di soluzione di viola cristallina (2,3% di viola cristallina, 0,1% di ossalato di ammonio e 20% di alcool etilico; Sigma). Le colonie eranocannerizzate con uno scanner per computer (Microtek) e contate manualmente.I test t dello studente sono stati eseguiti per valutare se le differenzetra le linee cellulari fossero statisticamente significative.

Test di crescita 3D

I test di crescita 3D sono stati eseguiti utilizzando lo stesso protocollo descritto in precedenza (17). In breve, gli sferoidi sono stati generati dalla coltura di cellule PC3 per 16 h come goccia sospesa su una piastra umidificata in un incubatore di CO2 in mediacontenente RPMI completo di metilcellulosa allo 0,5%. Gli sferoidi sono stati incorporati nella matrice di collagene (BD Biosciences), trattati con tilorone e immaginati utilizzando un microscopio Nikon Eclipse Ti (Nikon) il giorno del trattamento e sei giorni dopo l’inizio del trattamento. Le aree Spheroid e total (spheroidplus sprouts) sono state misurate con ImageJ. Gli aumenti di piega sono stati calcolati dividendo l’area sferoide / totale al giorno 6 per l’area sferoide/totale al giorno 0 per ogni singolo sferoide. Per ogni linea cellulare e punto temporale, sono stati risparmiati gli aumenti di piega di quattro sferoidi. Le analisi statistiche sono state eseguite utilizzando i test degli studenti.

Risultati

Soppressione dell’attività CDK5

Le cellule di cancro alla prostata PC3 sono state scelte per lo schermo JHDLcompound a causa del loro potenziale altamente metastatico e dell’indipendenza dagli estrogeni, assomigliando così al carcinoma prostatico metastaticocastrato-resistente aggressivo. L’attività di CDK5 è stata inibita datrasfezione e selezione di una mutazione dominante-negativa (CDK5144N). Queste cellule PC3 CDK5dn avevano un livello proteico più elevato di totalCDK5 rispetto alle cellule di controllo PC3 (cellule PC3 trasferite con un vettore vuoto) (Fig. 1 BIS). Un saggio di guarigione (8)ha confermato che il CDK5 era funzionalmente inattivo in queste cellule; a differenza delle cellule PC3control, le cellule PC3 CDK5dn non avevano la capacità di invadere la superficie raschiata (Fig.1 TER).

Schermata della libreria per i composti che prendono di mira le cellule PC3 in base all’attività CDK5

È stato eseguito un test di screening ad alto rendimento per selezionare i composti che prendono di mira le cellule PC3 in base all’attività CDK5. Le cellule PC3control e CDK5dn sono state trattate con tutti i composti delJHDL a 10 µM per 48 h. Per identificare i colpi che selettivamente targetPC3 cellule sulla base di espressione CDK5, abbiamo selezionato tutti i composti in cui il rapporto indice di proliferazione (CDK5dn / controllo) era inferiore a 0,5 o superiore a 1,5 (Fig. 2 BIS).Inoltre, gli hit dovevano inibire la proliferazione cellulare delle cellule PC3 di almeno il 10%, poiché eravamo specificamente interessati ai composti che inibivano la crescita cellulare (linea orizzontale e verticale nel grafico). Abbiamo anche selezionato tutti i composti che inibivano la proliferazione cellulare inPC3 del 70% (angolo in basso a sinistra del grafico), poiché eravamo interessati a identificare potenziali agenti antitumorali altamente efficaci. In totale, sono stati selezionati 41 risultati per ulteriori valutazioni.

È stata eseguita una schermata secondaria in cui sono stati aggiunti elementi selezionati dallo schermo primario a 10 µM per 48 h alle cellule PC3control e CDK5dn in triplice copia, per eliminare i falsi risultati positivi (Fig. 2 TER). I valori di cutoff erano leggermente meno severi rispetto allo schermo principale; i composti erano considerati un hit quando il rapporto degli indici di proliferazione(CDK5dn / controllo) era inferiore a 0,7 o superiore a 1,4. Ciò ha provocato l’identificazione di tre composti che selettivamente targetCDK5-esprimere le cellule PC3: rutilantina, etacridina lattato ecetalconio cloruro (Fig. 2 QUATER).Questi composti non sono stati utilizzati come agenti antitumorali e il loro potenziale uso clinico come agenti antitumorali per via endovenosa sembra limitato (20-23). Un altro composto, tilorone analogR9536-DA, è stato altamente efficace nell’inibire entrambe le linee cellulari PC3 isogeniche (inibizione>70%), ma ha inibito la proliferazione delle cellule PC3CDK5dn in modo un po ‘ più efficace (rapporto CDK5dn/controllo:0,687). Tilorone e i suoi analoghi hanno attività antivirale, agendo almeno in parte come induttori di interferone (24-26)e hanno dimostrato preclinicamente e clinicamente di avere anche antitumorattività (27,28).

Tilorone mira selettivamente alle cellule PC3 con bassa attività CDK5

Abbiamo continuato i nostri esperimenti con dicloridrato di tilorone appena sciolto. Dopo 72 ore di trattamento con tilorone atvarious concentrazioni, il suo IC50 è stato stabilito a 8-12µM in cellule PC3 CDK5dn e 15 µM in cellule di controllo PC3 in saggi MTS(Fig. 3 BIS). A 8 µM, l’attività proliferativa è diminuita del 24 e del 47% rispettivamente nelle cellule di controllo PC3 e CDK5DN (p=0,001). Per valutare la tossicità delle cellule prostatiche normali di tilorone, sono stati eseguiti saggi MTS con tiloronetrattamento dei fibroblasti della prostata umana (Fig. 3 TER). La sensibilità di queste cellule totilorone era simile a quella delle cellule di controllo PC3.

L’effetto inibitorio del tilorone nelle cellule PC3 è stato ulteriormente valutato eseguendo saggi clonogenici (Fig. 3 QUATER). Le cellule PC3 CDK5dn erano anche significativamente più sensibili delle cellule di controllo PC3 al tilorone in questo test. Il trattamento con tilorone da 10 µM ha determinato una sopravvivenza clonogenica del 40% nelle cellule PC3 CDK5dn e del 72% nelle cellule di controllo PC3(p=0,002).

È stato eseguito un test di crescita sferoide per valutare la crescita 3Dtumor e l’invasione delle cellule PC3 dopo il trattamento con tilorone(Fig. 4). Sia le celle PC3 control che PC3CDK5dn hanno avuto aumenti comparabili nelle dimensioni dello sferoide per sei giorni. Tuttavia, la dimensione totale (la dimensione degli sferoidi più i germogli) aveva un aumento della piega più elevato nelle cellule di controllo PC3, confermando che le cellule PC3 CDK5dn non trattate avevano un potenziale invasivo diminuito rispetto alle cellule di controllo PC3. Quando il tilorone è stato somministrato a 5µM, gli sferoidi di controllo PC3 hanno avuto una crescita simile e un modello invasivo come le cellule di controllo PC3 non trattate (p = 0,59) (Fig. 4B, grafico a sinistra). Tuttavia, quando il lorone è stato somministrato alla stessa concentrazione alle cellule PC3 CDK5DN, è stata osservata una significativa diminuzione sia della dimensione dello sferoide che della dimensione totale (p< 0,01), suggerendo che tilorone con successoinibisce la crescita dello sferoide e l’invasione delle cellule PC3 CDK5dn quando somministrato a 5 µM (Fig. 4B, grafico a destra). A 10 µM, entrambe le linee cellulari isogeniche avevano un potenziale invasivo diminuito.

Discussione

Il JHDL, una libreria di composti farmaceutici ben caratterizzatiè stato sviluppato per facilitare gli studi sulla formulazione dei farmaci (29). L’ampia tossicità in vivo e i profili farmacocinetici dei composti presenti nella libreria consentono un rapido sviluppo successivo di questi composti. Diversi composti dal JHDL sono stati advancedto studi clinici per il cancro e altre applicazioni terapeutiche (13,14,16,17,30–32).

Nel presente studio abbiamo esaminato i componenti JHDL che inibiscono in modo differenziale la crescita delle cellule tumorali nella presenza di inibizione CDK5; tilorone e un analogo di tilorone sono stati identificati come agenti che mirano selettivamente alle cellule tumorali PC3prostate carenti di CDK5. Tilorone (Amixin IC) è impiegato clinicalmentein alcuni paesi come agente antivirale attivo per via orale (25). Tilorone è stato testato su esseri umani per il trattamento di gliomi cerebrali, papillomatosi laringea ecancro al seno (28,33,34).Sebbene sia stata riportata efficacia antitumorale, l’interesse per la terapia con tilorone per il cancro si è attenuato. Recentemente, Zhou et al hanno riferitonuovi analoghi di tilorone con una migliore attività antitumorale (35). Questi analoghi possono essere promettenti toexamine, in particolare in combinazione con l’inibizione CDK5.

Oltre alla possibilità che il tilorone possa essere compromesso in combinazione con l’inibizione del CDK5, l’identificazione del tilorone come agente che mira selettivamente alle cellule all’interno del CDK5 attivo suggerisce potenziali classi di farmaci per potenziare l’efficacia dell’inibizione del CDK5. Tilorone è stato caratterizzato come induttore di uninterferone (24). Ciò suggerisce che l’interferone stesso, o un interferoninducer alternativo quale un agonista di TLR, può essere utile congiuntamente all’inibitore aCDK5. Tuttavia, altri meccanismi possono essere coinvolti. Ad esempio, il tilorone è anche un agente intercalante del DNA (24) e si può immaginare che possa modulare la struttura della cromatina e l’espressione genica. Altre functionsof tilorone, compreso la via di segnalazione e la trascrizione factorinteractions (36,37), possono anche essere coinvolte. Ulteriori studi sono necessari per svelare l’esatto meccanismo d’azione con cuilorone mira selettivamente al cancro alla prostata CDK5-negativocellule.

Ringraziamenti

Gli autori desiderano ringraziare i professori P. J. Van Diestand E. Van der Muro per il loro sostegno e la discussione e ProfessorsM.A. Carducci e J. T. Isaacs per la loro fornitura di materiali di laboratorio. Questo studio è stato supportato dall’Istituto di ricerca medica dell’assistente di volo, NCI R01 CA085567, R01 CA134767, DOD grantW81XWH-06-1-0139 e NCI SPORTIVO concessione P50 CA58236. M. D. W. è stato sostenuto dal programma di studio del Dott. Saal van Zwanenbergstichting e Huygens.