PMC

1protocolli dettagliati e suggerimenti per la risoluzione dei problemi per tutti gli aspetti del sistema di espressione della proteina di fusione genica GST sono disponibili da GE Healthcare nei manuali: GST Gene Fusion System, numero di prodotto 18-1157-58 e Recombinant Protein Handbook, numero di prodotto 18-1142-75. I manuali sono disponibili per l’acquisto in formato cartaceo o in formato PDF sul sito web di GE Healthcare.

2L’uso di JM105 o un ceppo simile è raccomandato per la clonazione e il mantenimento del vettore. I ceppi di BL21 e dei suoi derivati, o un altro ceppo carente di proteasi, sono raccomandati per la massima espressione proteica. Ceppi carenti di prodotti genici della proteasi citoplasmatica come lon, omt, degP o htpR possono ridurre al minimo gli effetti della degradazione proteolitica della proteina sovraespressa dall’ospite. Non utilizzare un ceppo di E. coli che trasporta l’allele rec1A per propagare i plasmidi pGEX, poiché sono state segnalate eliminazioni o riarrangiamenti del DNA plasmidico.

3Glutathione Sepharose 4B bulk media è utilizzato in questo protocollo di purificazione. Questo supporto cromatografico è ideale per le condizioni di screening e consente una facile scalabilità. Le purificazioni sono eseguite facilmente facendo uso di flusso di gravità o di un sistema di cromatografia a bassa pressione, o possono essere utilizzate nelle purificazioni in lotti basate su centrifugazione. Le colonne di affinità di GSTrap FF sono colonne preconfezionate da 1 ml o 5 ml che sono anche disponibili e possono essere collegate in serie per lo scale-up. Queste colonne sono per l’uso con un sistema cromatografico liquido, una pompa o una siringa. Oltre a questi formati, il glutatione sepharose inoltre è disponibile nelle colonne di rotazione e nei formati del piatto 96-well per la selezione rapida degli stati di espressione e di purificazione della proteina di fusione di GST.

4DFP è una neurotossina estremamente pericolosa. Seguire le precauzioni fornite dal produttore e maneggiare il reagente pulito solo in una cappa chimica.

5l’aggiunta di inibitori della proteasi al tampone di lisi aiuterà a prevenire la degradazione proteolitica della proteina bersaglio durante l’estrazione. Tuttavia, il cocktail esatto degli inibitori della proteasi aggiunti al tampone di lisi dovrebbe essere adattato alle caratteristiche della proteina bersaglio. Agenti riducenti come 2-ME, DTT o TCEP a concentrazioni di 1-10 mm devono essere aggiunti al tampone secondo necessità. L’aggiunta di un detersivo non ionico, quale 1% Triton X-100, inoltre può aggiungersi al cuscinetto per aiutare nell’estrazione.

6Following è un protocollo di screening per controllare i livelli di espressione proteica della proteina di fusione in mini-colture. La presenza di un aumento dei livelli di proteine al peso molecolare previsto su un gel SDS-PAGE dopo induzione con IPTG è una buona indicazione di espressione proteica di successo. Dopo l’induzione, dovrebbe essere visibile una banda prominente al peso molecolare previsto (peso molecolare della proteina bersaglio + ~ 26 kDa per la frazione GST). Se si sospetta che la proteina sia espressa a un livello basso, la verifica della corretta espressione può essere eseguita utilizzando Western blotting con un anticorpo specifico per la proteina target o GST. Se i campioni non saranno analizzati immediatamente da SDS-PAGE, possono essere conservati durante la notte a 4 °C o a -20 °C per la conservazione a lungo termine.

1. Inoculare diverse colonie isolate in provette da centrifuga separate da 50 ml contenenti 10 ml LB integrate con 100 µg/ml di ampicillina. Coltivare una coltura durante la notte a 37 °C con agitazione.

2. La mattina successiva, aggiungere 0,5 ml di coltura notturna a 4,5 ml LB con 100 µg/ml di ampicillina. Crescere 1 h a 37 °C.

3. Rimuovere 1 ml di campione non indotto. Centrifugare e rimuovere il surnatante. Congelare o conservare su ghiaccio fino al momento di eseguire SDS-PAGE.

4. Aggiungere IPTG ad una concentrazione finale di 1 mm e crescere per ulteriori 2-3 h.

5. Rimuovere 1 ml di campione indotto. Centrifugare e rimuovere il surnatante. Congelare o conservare su ghiaccio fino al momento di eseguire SDS-PAGE.

6. Risospendere il pellet cellulare in 200 µl SDS-PAGE sample buffer; calore 3-5 min a 90 °C.

7. Analizzare 5-10 µl utilizzando SDS-PAGE seguita da Coomassie colorazione blu (o 1-2 µl per Western blot).

7CAMPIONI coltivati in mini-culture possono anche essere utilizzati per valutare la solubilità di una particolare proteina di fusione (vedi Nota 6 per il protocollo di espressione di mini-culture). Alla fine del periodo di induzione, raccogliere le cellule mediante centrifugazione. Risospendere il pellet in 200 µl di PBS freddo. Lisare le cellule usando la sonicazione; tenere il campione sul ghiaccio. Salvare una piccola aliquota del lisato per l’analisi di SDS-PAGE. Centrifugare il campione lisato per 15 min. Rimuovere il surnatante in un tubo separato. Risospendere il pellet in 200 µl di PBS. Analizzare alcuni del lisato grezzo, il surnatante, e il pellet risospeso da SDS-PAGE o Western blotting. Se il campione è osservato sia nella frazione lisato che surnatante, il campione è adeguatamente solubile. Se il campione è presente principalmente nel lisato e nel pellet risospeso, il campione è molto probabilmente nei corpi di occlusione. Nei casi in cui la proteina si trova in corpi di inclusione, esplorare diverse condizioni di espressione per spostare l’espressione in una forma solubile (vedere Nota 8).

8Se la proteina di fusione è espressa principalmente in corpi di inclusione (ad es. > 80% insolubile), varie strategie possono essere impiegate per migliorare la solubilità. Spesso, l’induzione a temperatura più bassa (15-25 °C) è efficace nel spostare l’espressione dai corpi di inclusione alla frazione solubile. Le cellule indotte a questa temperatura più bassa cresceranno più lentamente e richiederanno periodi di induzione durante la notte. L’uso di ceppi ospiti alternativi o modifiche al costrutto plasmidico può essere necessario in alcuni casi. Se la proteina di fusione rimane principalmente nei corpi di inclusione anche dopo i tentativi di ottenere proteine solubili, può essere utile aumentare la produzione di E. coli e purificare abbastanza proteine dalla piccola quantità di proteine solubili che è disponibile. In alcuni casi, dovrebbero essere esplorati altri tag di proteine di fusione.

9 Bassi livelli di espressione proteica potrebbero essere il risultato di un uso raro di codoni. In questo caso, il passaggio a un altro ceppo di E. coli che contiene trascritti extra per il raro codone tRNA può migliorare significativamente la produzione di proteine. Diverse formulazioni media o aggiunta di fino 2% glucosio può anche migliorare l’espressione (13, 14). Se si sospetta che la proteina espressa sia tossica per le cellule (di solito smettono di crescere dopo l’induzione con IPTG), provare a indurre in un secondo momento per un periodo di tempo più breve. Diminuire la concentrazione di IPTG è un’altra opzione che dovrebbe essere esplorata.

10Monitor la crescita cellulare leggendo la densità ottica a 600 nm (A600). Una coltura durante la notte dovrebbe raggiungere un A600 ~1-1.2. Le cellule devono essere indotte in una fase iniziale della curva di crescita logaritmica per E. coli, A600 ~ 0,5-0,7. A 37 °C, ci vorranno circa 2 h per le colture per raggiungere uno stadio di crescita precoce. Se le cellule vengono coltivate a una temperatura più bassa, il tempo di incubazione deve essere aumentato, poiché le cellule cresceranno più lentamente a temperature più basse. Generalmente, il più grande rendimento della proteina di fusione sarà ottenuto quando le cellule sono indotte a A600 = ~ 0.5. Dopo l’induzione con IPTG, una linea guida generale per il tempo di incubazione è la seguente: 3 h a 37 °C, 5 h a 30 °C e durante la notte per 25 °C o inferiore. Raccogliere le cellule prima della saturazione, A600 ~ 1.0-1.2.

11per garantire un’adeguata aerazione, i flaconi devono essere riempiti solo al 20-30% della loro capacità.

12è importante che non siano presenti inibitori della serina proteasi nel campione prima della scissione con trombina o fattore Xa. I seguenti inibitori della proteasi devono essere rimossi prima della scissione della trombina o del fattore Xa: AEBSF, APMSF, antitrombina III, antipaina, α1-antitripsina, aprotinina, chimostatina, irudina, leupeptina e PMSF. Inoltre, Pefabloc TH benzamidina è specifico per la trombina e Pefabloc FXa è specifico per il fattore Xa. I seguenti inibitori della proteasi devono essere evitati con la proteasi di prescissione: 100 mm ZnCl2, 100 µM chimostatina e 4 mM Pefabloc.

13ci sono una serie di metodi alternativi per il rilevamento delle proteine di fusione GST. Per le proteine che esprimono bene ad un livello elevato, il metodo più semplice per monitorare la purificazione è tramite gel SDS-PAGE colorati con Coomassie blu o argento macchia. Un’alternativa per le proteine che esprimono a bassi livelli è quello di utilizzare Western blotting utilizzando un anticorpo diretto a GST o la proteina bersaglio. Un’alternativa per le espressioni su piccola scala è monitorare la presenza di GST con un saggio ELISA o CDNB enzyme.

14salva una piccola quantità di campione della proteina da ogni punto della purificazione, compreso lisi, surnatante, pallina, frazioni non legate dal caricamento del campione, dalle fasi del lavaggio e dalle fasi di eluizione da analizzare dalla SDS-PAGINA o dal Western blotting. Dopo che tutti i campioni sono stati analizzati e raggruppati, scartare le frazioni indesiderate.

Le proteine 15GST possono anche essere purificate utilizzando un metodo di purificazione batch. Un metodo di purificazione batch è veloce, facile e richiede poca attrezzatura; tuttavia, la proteina risultante può contenere più impurità e avere una resa inferiore rispetto a una purificazione basata sulla cromatografia. Le purificazioni batch sono utilizzate al meglio quando si selezionano le condizioni di purificazione. La purificazione del lotto descritta di seguito viene generalmente eseguita a temperatura ambiente. Per ridurre al minimo il rischio di degradazione proteolitica, la procedura può essere eseguita a 4 °C aumentando il tempo di incubazione da 2 a 4 volte.

1. Lisare le cellule e ottenere proteine di fusione solubili (vedere Note 8 e 21 se il campione è in corpi di inclusione).

2. Aggiungere 2 ml 50% slurry glutatione Sepharose bulk matrix (1 ml di volume del letto) per 100 ml di supernatante di lisato batterico. Incubare 30 min a temperatura ambiente con agitazione delicata.

3. Centrifugare 500 × g per 5 min. Rimuovere il surnatante e salvare per l’analisi di SDS-PAGE per determinare l’efficienza di legame.

4. Lavare la resina con 10 volumi letto PBS. Risospendere delicatamente, quindi centrifugare 500 × g per 5 min. Rimuovere il surnatante. Ripetere le fasi di lavaggio e centrifugazione per un totale di 3 lavaggi da 10 volumi letto ciascuno.

5. Elutare la proteina di fusione risospendendo la resina con 1,0 ml di tampone di eluizione del glutatione per ml di volume del letto. Incubare 10 min a temperatura ambiente. Centrifugare 500 × g per 5 min. Trasferire il surnatante contenente la proteina di fusione in un tubo separato. Ripetere i passaggi di eluizione e raccolta per un totale di 3 volte. I supernatanti possono essere raggruppati o analizzati separatamente da SDS-PAGE per monitorare il contenuto proteico (vedi Nota 12).

Il volume del letto 16A è uguale a metà del liquame 50% di glutatione Sepharose 4B utilizzato per la purificazione. Per preparare una sospensione al 50% di glutatione Sepharose (viene fornita come sospensione ~ 75%): determinare il volume del letto richiesto per la scala di purificazione. Risospendere il glutatione Sepharose 4B. Per ogni ml di volume del letto richiesto, pipettare 1,33 ml della sospensione al 75% in una provetta da centrifuga di dimensioni appropriate. Centrifugare a 500 × g per 5 min. Decantare il super. Lavare con 10 volumi di letto (10 ml per 1,33 ml di liquame originale) di PBS invertendo delicatamente il tubo più volte per mescolare, quindi centrifugare 500 × g per 5 min. Decantare il super. La mancata rimozione della soluzione di stoccaggio di etanolo può interferire con le successive fasi di legame. Aggiungere 1 ml di PBS per ogni 1,33 ml della sospensione originale. Ciò si traduce in una sospensione del 50%.

17Glutathione Sepharose ha una capacità di legame minima pubblicizzata di 8 mg / ml. Una colonna da 20 ml deve essere adeguata per purificare le proteine provenienti da colture di E. coli da 3 × 600 ml che contengono ~ 20-40 mg di proteina di fusione per coltura. Sia la quantità di resina utilizzata che la dimensione della colonna possono essere ridimensionate verso l’alto o verso il basso a seconda della quantità di proteine da purificare.

18sospendere il pellet utilizzando 25-50 µl di tampone di lavaggio per ml di coltura originale.

19l’interruzione della cella è completa quando la sospensione si schiarisce parzialmente e assume un colore leggermente più scuro. Evitare la formazione di schiuma durante la sonicazione, in quanto ciò può portare alla denaturazione della proteina di fusione. Evitare la sovrasonicazione, in quanto ciò può portare alla co-purificazione delle proteine dell’ospite E. coli insieme alla proteina di fusione GST. L’alta viscosità dovuta al rilascio di acidi nucleici durante la sonicazione può essere ridotta aggiungendo DNasi o benzoasi al tampone di lisi. Lisozima fino a una concentrazione di 0.2 mg / ml possono essere aggiunti come aiuto alla lisi cellulare. Un’alternativa alla sonicazione è l’uso di formulazioni di estrazione cellulare disponibili in commercio. Tuttavia, questi prodotti potrebbero contenere componenti proprietari che interferiscono con le applicazioni a valle.

20Se i tentativi di spostare l’espressione dai corpi di inclusione alla frazione solubile falliscono, le proteine di fusione GST insolubili a volte possono essere purificate in presenza di denaturanti come l’urea, seguita da refolding. Anche la solubilizzazione con detergenti come sarkosyl (N-laurilsarosina) è stata impiegata con successo (15, 16). Sebbene il seguente protocollo sia stato utilizzato con successo per denaturare e ri-naturare le proteine di fusione GST, ogni costrutto della proteina di fusione è unico e le condizioni esatte di denaturazione e ri-naturazione devono essere determinate empiricamente. Denaturanti comuni che sono stati impiegati con successo includono guanidina HCl, urea, Tween 20, CTAB e SDS (17, 18). I denaturanti quindi devono essere completamente rimossi per consentire il corretto refolding della proteina. Le condizioni che dovrebbero essere ottimizzate per facilitare il refolding includono: tipo di denaturante, pH, presenza di agente riducente, velocità di rimozione del denaturante e concentrazione proteica. Una volta che la proteina è stata ri-natura, verificare che la proteina ha riacquistato la sua conformazione nativa e la funzione e rimuovere qualsiasi proteina impropriamente piegato.

1. Pre-equilibrare la colonna di glutatione Sepharose; sonicare le cellule di E. coli pellettate e separare le frazioni di supernatante e pellet di lisato mediante centrifugazione (vedere 3.3 Purificazione di affinità delle fasi 1-8 della proteina di fusione GST). Risospendere il pellet di lisato che include i corpi di inclusione, in tampone di lavaggio da 15 ml. Centrifugare 20 min a 48.000 × g (4 °C). Decantare il surnatante e risospendere il pellet lavato in 12 ml di tampone U (risospendere in 20 µl di tampone U per ml di coltura originale). Incubare 2 h su ghiaccio.

2. Centrifugare 20 min a 48.000 × g (4 °C). Trasferire il surnatante contenente la proteina di fusione denaturata in una provetta da centrifuga pulita.

3. Aggiungere Triton X-100 al surnatante ad una concentrazione finale dell ‘ 1%.

4. Dializzare il campione in PBS / glicerolo per 2-3 h. Il volume del tampone di dialisi deve essere almeno 20 volte il volume del campione.

5. Dialyze il campione durante la notte contro PBS con gli inibitori della proteasi facendo uso di un volume di riserva che è >100 volte il volume del campione.

6. Rimuovere il campione dalla dialisi e centrifugare 20 min a 4.000 × g.

7. Le proteine estratte e ri-naturate dai corpi di inclusione ora possono essere applicate alle colonne di glutatione sepharose e purificate.

Soluzioni:

tampone di Lavaggio: 50 mM Tris, 5 mM EDTA, 1 µg/ml leupeptin, 1 µg/ml pepstatin, 0.15 mm PMSF, pH 8.0

U buffer: 5 M urea, 50 mM Tris, 5 mM EDTA,5 mM 2-MI, 1 µg/ml leupeptin, 1 µg/ml pepstatin, 0.15 mM PMSF, 1 mM DFP pH 8.0

PBS/glicerolo: 1X PBS, 20% glicerolo, 1% Triton X-100, 5 mM 2-MI, 5 mM EDTA, 5 mM 2 – MI, 1 µg/ml leupeptin, 1 µg/ml pepstatin, 0.15 mM PMSF, 1 mM DFP pH 7.4

21Use di una pompa peristaltica è consigliato in modo uniforme di controllo di flusso di costo. Se si verifica la compressione della resina, la pressione è troppo alta e la portata deve essere ridotta.

22la cinetica di legame tra glutatione e GST è relativamente lenta. Pertanto è importante utilizzare basse portate per ottenere la massima capacità di legame, ad esempio 0,1 ml / min per una colonna ID di 2,5 cm. Facendo uso delle portate che sono troppo veloci può fare diminuire la quantità di proteina legata di fusione dovuto la cinetica lenta dell’associazione. Le fasi di lavaggio ed eluizione possono essere eseguite a portate più veloci per risparmiare tempo (1,5 ml/min e 0,3 ml/min, rispettivamente). Per campioni di grandi volumi, la rilegatura viene eseguita più convenientemente durante la notte, con regolazioni delle portate in modo che la colonna non si asciughi.

23l’analisi delle frazioni non legate indicherà se la proteina di fusione si lega o meno. Se la proteina non viene rilevata nelle frazioni iniziali ma appare nelle frazioni successive, indica che la capacità della colonna è stata superata. La riduzione del carico proteico o l’aumento delle dimensioni della colonna allevieranno questa condizione.

24Se la proteina di fusione si lega male al glutatione Sepharosio, ci sono diverse alternative per provare ad aumentare l’efficienza di legame. Prova un metodo di lisi più delicato. Se il metodo utilizzato è troppo duro, la proteina può diventare denaturata e, quindi, incapace di legarsi alla colonna. Inoltre, se ri-naturing la proteina dai corpi dell’inclusione, sia sicuro che tutti i denaturanti siano stati rimossi dal cuscinetto, con la dialisi esaustiva o l’applicazione del campione ad una colonna di dissalazione, prima dell’applicazione alla colonna del glutatione. Rimuovere la soluzione di stoccaggio di etanolo dal glutatione Sepharose; ridurre la colonna con un tampone di glutatione fresco seguito da un lavaggio con PBS immediatamente prima del caricamento del campione. Aumentare la quantità di resina e / o diminuire la portata utilizzata per caricare il campione. Prova ad aggiungere 1-20 mm DTT al campione. Se il problema persiste, pulire la colonna secondo le raccomandazioni del produttore. Se il legame non viene ancora ripristinato, provare a utilizzare resina fresca.

25la resa della proteina di fusione può anche essere stimata misurando l’assorbanza a 280 nm (A280). Il coefficiente di estinzione per la frazione GST da solo è ~ 1.5, cioè 1.00 A280 = ~ 0.6 mg / ml di proteina, anche se il coefficiente di estinzione per la proteina di fusione dipenderà in parte dalle caratteristiche di assorbanza della proteina bersaglio.

26Se c’è un problema eluendo la proteina dalla colonna di glutatione Sepharose, provare a diminuire la portata e aumentare il volume di tampone di eluizione che viene utilizzato. Assicurarsi di utilizzare il buffer di glutatione fresco ridotto (renderlo il giorno in cui verrà utilizzato). Aumentare la concentrazione di glutatione fino a 40 mM e / o aumentare il pH del tampone a pH 8,0–9,0. Aggiungere 1-20 mm DTT (o altro agente riducente) al buffer. L’aggiunta di un detergente non ionico può anche migliorare la solubilizzazione e ridurre al minimo qualsiasi aggregazione che possa verificarsi.

27la contaminazione della proteina di fusione purificata con le proteine delle cellule ospiti di E. coli è un’indicazione che la sonicazione è stata troppo severa. Se sono presenti frammenti degradati della proteina di fusione, provare ad aggiungere ulteriori inibitori della proteasi al tampone di lisi. Tenere tutti i campioni, tamponi e tubi di raccolta freddo per ridurre al minimo la proteolisi. Se la degradazione si verifica durante l’espressione della proteina, provare a indurre il campione in ritardo (~0.8 OD600) e diminuire la durata del periodo di induzione. Il passaggio a un ceppo ospite alternativo può anche aiutare.

28UN’alternativa alla digestione in soluzione è la scissione della proteasi della proteina di fusione mentre legata alla matrice di glutatione sepharosio. La proteina di fusione viene estratta e caricata sul glutatione Sepharosio seguito dal lavaggio con PBS (vedere Purificazione di affinità della proteina di fusione GST, passaggi 1-11). Invece di elutare la proteina con tampone glutatione, una soluzione di PBS contenente l’enzima viene caricata sulla colonna e incubata per diverse ore a temperatura ambiente (4 °C per la proteasi di prescissione). La proteina scissa viene quindi lavata dalla colonna con diversi volumi di colonne di PBS. La proteina di fusione residua e la frazione GST possono essere rimosse dalla colonna lavando la colonna con un buffer di glutatione ridotto. La quantità di enzima e il tempo di incubazione devono essere determinati empiricamente per ciascuna proteina di fusione. Analizzare tutti i campioni di SDS-PAGE per determinare l’efficienza di scissione e la purezza delle proteine.

29In una scissione della proteasi in modalità batch, aggiungere una quantità empiricamente determinata di enzima alla proteina di fusione legata alla resina (vedere Nota 15 a–d). Utilizzare 1 ml di enzima contenente PBS per ml di volume del letto. Incubare a temperatura ambiente per diverse ore con leggera agitazione. Centrifugare 500 × g per 5 min per sedimentare la resina. Rimuovere il super che contiene la proteina bersaglio in un tubo separato. Lavare il glutatione Sepharose con PBS fino a 3 volte per recuperare la proteina di fusione scissa. Incubare la resina con tampone glutatione per rimuovere la GST e la proteina di fusione residua. Utilizzare 1 ml di tampone glutatione per ml di resina. Centrifugare 500 × g e recuperare GST eluito. Ripetere fino a 3 volte. Analizzare i campioni di SDS-PAGE.

30Se si utilizza la proteasi della trombina, la digestione può essere effettuata nel tampone glutatione utilizzato per eluire la proteina dalla colonna. Se si utilizza il fattore Xa, si raccomanda di dializzare la proteina in un tampone Tris o in un tampone PBS prima della digestione; il glutatione presente nel tampone di eluizione può interrompere i ponti disolfuro presenti nel fattore Xa portando a una digestione inefficiente della proteina di fusione. Una determinazione empirica delle condizioni di digestione per ciascuna proteina di fusione deve essere determinata in un esperimento pilota di digestione. Un metodo conveniente è quello di digerire 100 µg di proteina di fusione su una gamma di rapporti enzima-substrato e variare il tempo di incubazione. I tempi di incubazione tipici vanno da 2 a 8 ore. I rapporti enzima-substrato raccomandati per la trombina sono 1:100, 1:350, 1:1000, e 1:3000 (unità di enzima per µg di proteina di fusione) e per il fattore Xa sono 1:10, 1:25, 1:50, 1:100, 1:300 (µg enzima per µg proteina di fusione). Ai punti di tempo desiderati, rimuovere 2 µg di proteine e interrompere la digestione aggiungendo l’aliquota del campione al tampone di campionamento SDS bollente. Analizzare i campioni per SDS-PAGE per determinare le condizioni ottimali di scissione. Oltre al rapporto enzima-substrato e al tempo, prendere in considerazione l’alterazione delle condizioni del buffer, come l’aumento o la diminuzione della concentrazione di NaCl o l’aggiunta di Ca2+ al buffer (vedere la Nota 31 per suggerimenti sulla risoluzione dei problemi).

31Se su SDS-PAGE si osservano più bande per la proteina target dopo la digestione, controllare la sequenza proteica target per potenziali siti di riconoscimento della proteasi secondaria. Se esistono siti di scissione secondari, ri-clonare in un vettore diverso. Se non si osserva alcuna scissione, controllare la sequenza del DNA per verificare la presenza e l’integrità del sito di scissione della proteasi previsto. Assicurarsi che gli inibitori della proteasi siano stati rimossi completamente dal tampone. Aggiungere più enzima e / o aumentare i tempi di incubazione durante la notte. Se la digestione rimane incompleta ai più alti rapporti enzima-substrato e ai punti di tempo più lunghi, considerare la riprogettazione del sito di scissione della proteasi per includere diverse glicine tra la porzione GST e la proteina bersaglio per ridurre la probabilità che l’ostacolo sterico interferisca con la scissione (19, 20).

32Se l’inibizione dell’enzima dopo che la digestione è completa usando gli inibitori della serina proteasi è indesiderabile, il campione può essere applicato ad una colonna della benzamidina di HiTrap per rimuovere l’enzima dal campione.

33Se il campione deve essere ri-cromatografato sulla colonna glutatione Sepharose per rimuovere GST e qualsiasi proteina di fusione non digerita, è fondamentale che il glutatione ridotto sia rimosso completamente dal campione. Il glutatione si equilibra molto lentamente attraverso le membrane di dialisi; pertanto se si utilizza un tubo di dialisi con un MWCO <12.000, possono essere necessari 3 o più cambiamenti di tampone per la rimozione completa. Un aumento del tempo di dialisi (durante la notte) e un volume maggiore di tampone possono anche essere necessari per grandi volumi di campioni.

34la stessa colonna di glutatione sepharosio può essere utilizzata sia per l’isolamento iniziale della proteina di fusione che per la reimpurificazione dopo scissione enzimatica. Si raccomanda di dedicare una singola colonna a un singolo costrutto proteico per evitare potenziali contaminazioni incrociate di diverse proteine ricombinanti. Le colonne possono essere riutilizzate più volte. Se l’efficienza di rilegatura diminuisce nel tempo, pulire la colonna secondo le raccomandazioni del produttore. Se l’attività di associazione non viene ripristinata, è necessario utilizzare una nuova colonna.

35il legame massimo si verifica se la colonna è completamente ridotta; tuttavia, se la colonna del glutatione sepharose è stata lavata meno di 48 h prima di questo punto, questo punto può essere saltato.

36la proteina bersaglio sarà nella frazione non legata e la GST e qualsiasi proteina di fusione non scissa si legheranno alla colonna.

37piccoli volumi di campione sono raccomandati per una buona risoluzione delle proteine bersaglio rispetto ad altri contaminanti. Se non è possibile concentrare il campione in un piccolo volume, possono essere eseguite iniezioni multiple del campione.