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CPV-2 è il principale agente eziologico della gastroenterite virale nei cani. È un membro della famiglia Parvoviridae, appartenente al genere Protoparvovirus e alle specie Protoparvovirus di tipo 1. È un virus non avvolto con un singolo genoma incagliato del DNA, whichencodes per due proteine del capside, VP1 e VP2, richieste per l’assemblea e l’imballaggio del genoma virale come pure per le proteine non strutturali NS1 e NS2, whichaid nel controllo della replicazione del DNA, dell’assemblea e della regolazione dell’espressione dei geni .

Negli ultimi anni, CPV-2 ha sviluppato nuove varianti antigeniche. Nel 1980, il ceppo originale CPV-2 è stato sostituito dalla variante designata tipo 2a (CPV-2a), nel 1984 è stato identificato il CPV-2b e nel 2001 è stato rilevato e segnalato in Italia il CPV-2c. Anche l’ultima variante è stata identificatain Asia, Africa e America. A causa dell’esistenza di molteplici varianti antigeniche per CPV-2, i segni clinici possono variare grandemente .Successivamente, i veterinari hanno meno certezza quando emettono la loro diagnosi presuntiva e, di solito, sono necessari alcuni test di laboratorio perconfermare la loro diagnosi; anche se diverse tecniche sono state sviluppate nei laboratori di ricerca, come emoagglutinazione dosaggi, immunofluorescenza, ELISA, PCR,immunochromatography di prova e di coltura cellulare (tra gli altri), in realtà le tecniche con la massima disponibilità all’interno di laboratori di analisi clinica veterinaria hospitalsonly sono immunochromatography test e PCR, tuttavia, nella ricerca circa la sensibilità e la specificità di queste procedure, i rapporti sono controversi.Inoltre, nei pazienti con vari gradi di gravità della malattia, la sensibilità e la specificità di queste tecniche non sono state ampiamente studiate.

L’obiettivo di questo studio è quello di segnalare i vantaggi e gli svantaggi offerti dal test di immunocromatografia e PCR per la diagnosi di pazienti che presentano un’ampia diversità di segni clinici per CPV-2.

Questo studio è stato condotto secondo le linee guida della norma ufficiale messicana di ricerca animale sperimentale NOM-062-ZOO-1999.

I cani con enterite clinica ricoverati nell’Ospedale veterinario per piccoli animali dell’Universidad Autónoma de Estado de México, sono stati sottoposti a screening per questostudio e selezionati in base al test positivo o negativo CPV-2 utilizzando PCR nidificato (nPCR). Di conseguenza, 45 cani che sono risultati positivi sono stati selezionati, e 5 cani negativelytested sono stati inclusi come controlli. I 50 cani sono stati esaminati clinicamente da tre veterinari contemporaneamente per ottenere la sensibilità della diagnosi clinica. Ciascunoveterinario ha emesso la sua diagnosi presuntiva in modo discreto, utilizzando la cartella clinica veterinaria orientata ai problemi (POVMR) come strumento diagnostico.

Successivamente, i campioni fecali di tutti i cani sono stati analizzati tramite PCR e test di immunocromatografia, mentre i campioni di sangue sono stati utilizzati per eseguire un esame emocromatografico completo.

nPCR è considerato una tecnica altamente affidabile e sensibile per identificare le particelle virali CPV-2, e quindi, in questo studio, la sensibilità dei test utilizzati è stata correlata a quelli ottenuti in precedenza da nPCR, per CPV-2diagnosi.

Campioni di feci di cane sono stati ottenuti utilizzando tamponi rettali, che sono stati sospesi in acqua priva di nucleasi e 200 µl degli omogenati, e sono stati utilizzati per l’estrazione del DNA. La procedura è stata eseguita utilizzando il kit di estrazione del DNA delle feci QIAamp® DNA (QIAGEN, Mainz, Germania), seguendo le istruzioni del produttore. I campioni di AllDNA sono stati quantificati utilizzando uno spettrofotometro Q5000 Quawell (Quawell Technology, Inc., San Jose, CA, U. S. A.). 100 ng di DNA di ciascun campionesono stati utilizzati per reazioni PCR con 50 µl di volume finale. In precedenza, una coppia di primer è stata progettata nel nostro laboratorio per amplificare un frammento di 275 bp,ParvoInt2FB (5′-TCAAGCAGATGGTGATCCAAG-3′) e ParvoInt2CR (5′-GGTACATTATTTAATGCAGTTA-3′) situato a nucleotidi 1,107–1,130 e 1,360–1,382 del gene VP2 (GenBankaccession number FJ0051962c).

Le reazioni di PCR sono state eseguite utilizzando 2 µl di ciascun primer (200 nM), 12,5 µl di GoTaq® Green Master Mix (Promega, Madison, WI,U. S. A.) contenenti DNA polimerasi, tampone di reazione (pH 8,5) e 400 µM di ciascun nucleotide (dATP, dGTP, Dctp e dTTP); 3 mm di MgCl2.e 28.5 µl di acqua priva di nucleasi. Tutte le reazioni sono state effettuate nelle seguenti condizioni di amplificazione; 1 ciclo a 94 ° C per 5 min per la denaturazione iniziale, seguito da 35 cicli a 94 ° C per 30 sec, 52 ° C per 1 min, 72°C per 1 min e un ciclo di estensione finale a 72°C per 5 min.

nPCR è stato inizialmente fatto per amplificare un frammento di 1,740 bp utilizzando ParvoExt1f (5′-ATGAGTGATGGAGCAGTTCA-3′) e ParvoExt3R (5′-AGGTGCTAGTTGAGATTTTTCATATAC-3′) primer,e sono stati progettati utilizzando le sequenze nucleotidiche 1-20 e 1,712–1,740 dal gene VP2 per parvovirus canino (GenBank adesione numero FJ0051962c). La reazione erastandardizzato ad un volume finale di 50 µl.

La miscela di reazione conteneva 1 µl di GoTaq® Flexi DNA Polimerasi 5 U/µl (Promega), 5 µl di GoTaq® Flexi buffer 5XGreen, 3 µl di MgCl2 25 mM, 4 µl di dNTP 200 µM, 2 µl di primer, 10 µl di DNA con una concentrazione finale di 100 ng e 23 µl di acqua libera da nucleasi. La reazione è stata effettuatasotto le seguenti condizioni di amplificazione: 1 ciclo a 94°C per 5 min, seguito da 35 cicli a 94°C per 30 sec, 50°C per 45 sec, 72°C per 1 min e 1 ciclo a72°C per 5 min. Successivamente, 1 µl del prodotto di questa reazione è stato utilizzato come modello di DNA per la procedura di nidificazione, e primer e condizioni di amplificazione erano le stesse per il frammento di 275 bp.

Tutti i prodotti di amplificazione sono stati identificati mediante elettroforesi orizzontale in gel di agarosio al 2% colorati con 0,5 µg/ml di bromuro di etidio e visualizzati con un transilluminatore UV.

Per l’analisi del test di immunocromatografia per il parvovirus canino (CPV Ag), il kit ANIGEN® (Bionote Inc., Gyeonggi-do, Corea) è stato utilizzato. Ogni test è stato effettuato seguendo le istruzioni del produttore.

Campioni di sangue sono stati prelevati dalla vena giugulare utilizzando provette vacutainer con EDTA come anticoagulante. La conta completa delle cellule del sangue (CBC) è stata eseguita utilizzando un contatore cellulare automatizzato (QBC vet-IDEXX Laboratories, Inc., Westbrook, ME, U. S. A.). I film di sangue sono stati macchiati con Wright-Giemsa ed esaminati sotto un fotonicomicroscopio. La leucopenia è stata presa in considerazione quando una conta CBC totale era inferiore a 6 × 103 / µl .

L’analisi dei risultati è stata eseguita attraverso l’uso di una matrice per variabili codificate e sono state create tabelle di contingenza per determinare le proprietà del test diagnostico . Inoltre, la statistica Kappa è stata determinata a valutare l’accordo tra i tre test utilizzati e NPCR. Il valore kappa è stato caratterizzato secondo Kantere e colleghi in 2015 whereKappa valore 1 indica accordo assoluto, mentre un valore di 0 indica che l’accordo si verifica a causa del caso. In generale,valori Kappa superiori a 0,6 indicano un buon livello di accordo; l’analisi è stata effettuata utilizzando il pacchetto statistico SPSS Ver. 22.0 (IBM, Inc., Armonk, NY, U. S. A.).

Novantuno punti uno (91,1) % dei cani positivi per CPV-2 da nPCR erano di razza pura; 95.il 5% dei pazienti aveva tra i due e gli otto mesi e il 4,5% era più vecchio di un anno. Per quanto riguarda il loro stato di vaccinazione, il 40% è stato vaccinato almeno una volta per prevenire l’infezione da CPV-2.

La frequenza dei segni clinici mostrati da questi cani era la seguente: il 44,4% mostrava vomito e diarrea; il 20% aveva febbre, vomito e diarrea(catarrale o emorragica); il 17,7% mostrava solo diarrea; l ‘ 8,8% mostrava solo vomito; e il 4,4% aveva diarrea e febbre e il 4,4% presentava vomito e febbre.Leucopenia è stata osservata nel 48,8% dei cani (Tabella 1).

Utilizzando l’esame clinico, i veterinari hanno diagnosticato solo il 57,8% dei pazienti positivi al CPV-2 e il 100% dei cani negativi; pertanto, il valore di sensibilità perla diagnosi clinica è stata stimata come 57,7% (CI0, 95 42,2–72) e la specificità osservata è stata del 100% (CI0, 95 46,2–98,8).

Per quanto riguarda la diagnosi dei test di laboratorio, su 100% dei cani che sono risultati positivi attraverso nPCR, solo 30/45 di questi pazienti erano CPV-2 positivi attraverso il test immunocromatografico, mentre i cinque pazienti di controllo che sono risultati negativi per CPV-2 sono stati correttamente diagnosticati. Pertanto, questa tecnica ha mostrato una sensibilitàdi 66,6% (CI0, 95 50,9–79,5) e la specificità osservata era del 100% (CI0, 95 46,2–98,8).

Utilizzando la tecnica PCR, 36/45 pazienti sono risultati positivi al CPV-2 e i cinque pazienti di controllo sono stati confermati negativi per tutta la nPCR. Pertanto, la PCR ha dimostrato un’asensibilità dell ‘ 80% (CI0.95 63,1–87,7) e una specificità del 100% (CI0.95 67,8–99,1) (Fig. 1).

L’accordo tra le tre tecniche è dimostrato attraverso il valore Kappa (Tabella 2).

La gastroenterite causata da CPV-2 è considerata una delle principali malattie virali che colpiscono i cani. Sebbene i segni clinici dell’infezione da parvovirus canino possano variare, i segni più comuni riportati sono stati: anoressia, depressione, letargia, febbre ,diarrea mucoide ed emorragica e leucopenia ; nei casi subclinici, alcuni di questi segni possono o non possono essere presenti .

Durante l’esame clinico, è stata osservata variabilità nelle manifestazioni cliniche dell’infezione. Solo il 20% dei cani studiati ha presentato segni tipici come comunementedescritto in letteratura. La variabilità clinica per questa malattia è stata riportata in precedenza e alcuni autori hanno discusso fattori, come l’età, lo stato immunitario, la via di esposizione, la dose virale, la virulenza dei ceppi e la co-infezione conaltri agenti infettivi come possibili cause . Ciò complica l’ottenimento di una diagnosi accurata di CPV-2 quando i veterinari si affidano esclusivamente al loro esame clinico. Pertanto, per quanto riguarda il nostroinvestigazione basata esclusivamente su questa procedura, il 42,2% dei cani avrà una diagnosi CPV-2 falso negativo.Attraverso le cartelle cliniche dei cani in questo studio, abbiamo osservato che i veterinari escludevano la possibilità di infezione principalmente perché i cani non mostravano i segni clinici classici descritti in letteratura, erano stati vaccinati contro il CPV-2 e/o erano adulti. Tuttavia, la maggior parte dei cani nel nostro studio mostrava segni atipici. Pertanto, riteniamo che le infezioni subclinichedi CPV-2 siano più comuni e che i veterinari, che devono decidere se utilizzare o meno test diagnostici aggiuntivi con alta sensibilità e specificità, debbano considerare seriamente questi risultati.

In questo studio, il 40% dei pazienti positivi al CVP-2 era stato precedentemente immunizzato. È noto che la tecnica PCR è altamente sensibile e quindi rilevaparticelle virali di vaccino nelle feci da pazienti vaccinati di recente; gli studi indicano che è possibile ottenere risultati falsi positivi dai giorni 3 ai 10post-vaccinazione con un vaccino CPV vivo modificato . Di conseguenza, per eseguirequesto studio, i pazienti con storia di vaccinazione nei 15 giorni precedenti sono stati esclusi. Inoltre, campioni di cani vaccinati positivi a CPV-2 sono stati sequenziati e,in tutti i casi studiati, è stato identificato il CPV-2c genovariante (dati non mostrati), il che implica che i cani sono stati infettati con CPV-2c di campo, sapendo che non CPV-2cvaccine è ancora disponibile in Messico. Inoltre, in Messico, Pedroza e colleghi hanno riferito che la variante antigenica più comune nei cani infetti era CPV-2c .

D’altra parte, molti veterinari considerano la presenza di leucopenia, un fattore di supporto per la diagnosi di CPV-2. Tuttavia, abbiamo osservato che solo 48.l ‘ 8% (22/45) dei cani studiati ha presentato leucopenia durante la valutazione, il che è coerente con altri rapporti che indicavano che circa il 50% dei cani non mostra alterazioni ematologiche al momento della valutazione . Pertanto, un CBC è uno strumento prezioso che può fornire informazioni suls gravità della malattia, suggerendo una prognosi e determinando la risposta al trattamento. Tuttavia, la leucopenia non deve essere considerata come uno strumento diagnostico per CPV-2, perché non fornisce una prova per la presenza di virus.

Varie tecniche di identificazione virale sono utilizzate per la conferma definitiva dell’infezione da CPV-2, ad esempio test rapidi basati sull’immunocromatografiasono ampiamente utilizzati dai medici, perché la procedura è facile, veloce e accessibile. Inoltre, non richiede la preparazione del campione o l’invio a un laboratorio specializzato per l’analisi. La sensibilità variabile di questo test è il suo lato negativo; diversi studi hanno indicato che la sua sensibilità varia dal 50 al 100% , e nel nostro studio, la sensibilità comparativa con nPCR era del 66,6%. Alcuni studi havesuggested che la sensibilità bassa di tecnica è dovuto il bisogno di grandi quantità virali delle particelle di essere versato nelle feci dei cani per ottenere un positivediagnosis . L’uso di questa tecnica deve essere riconsiderato, poiché è prevista una maggiore probabilità di risultati falsi negativi. Per evitare ciò, devono essere utilizzate ulteriori tecniche, con sensibilità più elevate .

Diversi studi hanno dimostrato l’elevata sensibilità dei test basati sulla PCR; attualmente, ci sono più varianti della stessa procedura che offrono sensibilitàrange dall ‘ 80 al 100% . Nel presente studio, la PCR aveva una sensibilità dell ‘ 80%, ed è degno di nota menzionare che i pazienti sono stati identificati solo positivi all’infezione attraverso nPCR nel frattempo né la PCR né i test di immunocromatografia sono stati in grado di identificarlo.

Per quanto riguarda il valore kappa, abbiamo confrontato i risultati tra i tre metodi analizzati con nPCR. Tuttavia, è stato dimostrato lo scarso accordo tra diagnosi clinica e NPCR; è stato osservato un accordo moderato tra PCR convenzionale e NPCR che può essere dovuto alla somiglianza tra i due test.

Per quanto riguarda i segni clinici, la presenza di vomito o diarrea è stata osservata in tutti i pazienti con infezione virale, mentre altri segni clinici non sono stati considerati rilevanti per l’infezione; in accordo con i segni clinici e la sensibilità delle tecniche utilizzate, non è stata osservata alcuna relazione. Ad esempio, il caso n.26 ha mostrato solo vomito come segno clinico, ed è stato ritenuto negativo per CPV-2 dalla diagnosi clinica veterinaria, tuttavia, il test di immunocromatografia, PCR e nPCRtests erano positivi a CPV-2. Inoltre, i casi 41 e 42 in cui il principale segno clinico era la diarrea, potevano essere diagnosticati solo positivi al CPV-2 utilizzando nPCR.

I nostri dati indicano che i test diagnostici più frequentemente utilizzati nei laboratori veterinari clinici e diagnostici per rilevare il CPV-2 sono altamente specifici, ma sono privi di sensibilità, che impedisce la diagnosi precisa di CPV-2. Nel nostro studio, la PCR e il test immunocromatografico non erano così sensibili come nPCR, che è stato confermatoin precedenti indagini, tuttavia,l’uso di nPCR come test di diagnosi non è ancora ampiamente diffuso negli ospedali veterinari, mentre rimane ampiamente utilizzato per scopi di ricerca.

D’altra parte, la PCR in tempo reale, che è anche altamente sensibile, è usata raramente, a causa dei suoi alti costi delle attrezzature e della necessità di un personale altamente specializzato per la sua gestione. Tuttavia, i progressi tecnologici hanno permesso a queste tecniche di diventare più economiche e più semplici da utilizzare, il che potrebbe portare alla loro applicazione diretta negli ospedali veterinari per migliorare l’accuratezza diagnostica del CPV-2.