Protein purificationEdit
Polyhistidine-tag sono spesso utilizzati per la purificazione di affinità di proteine ricombinanti poliistidine-tag espressi in Escherichia coli e altri sistemi di espressione procarioti. Le cellule batteriche vengono raccolte tramite centrifugazione e il pellet cellulare risultante viene lisato con mezzi fisici o mediante detergenti ed enzimi come il lisozima o qualsiasi combinazione di questi. In questa fase, il lisato grezzo contiene la proteina ricombinante tra molte altre proteine provenienti dall’ospite batterico. Questa miscela è incubata con una resina di affinità contenente ioni bivalenti legati di nichel o cobalto, che sono disponibili commercialmente in diverse varietà. Nichel e cobalto hanno proprietà simili e come sono adiacenti periodo 4 metalli di transizione (v. triade di ferro). Queste resine sono generalmente sepharose / agarose funzionalizzate con un chelante, come l’acido iminodiacetico (Ni-IDA) e l’acido nitrilotriacetico (Ni-NTA) per il nichel e l’aspartato carbossilico-metilico (Co-CMA) per il cobalto, che la poliistidina-tag si lega con affinità micromolare. Ernst Hochuli et al. accoppiato 1987 il ligando NTA e nichel-ioni di perle di agarosio. La resina viene quindi lavata con tampone fosfato per rimuovere le proteine che non interagiscono specificamente con lo cobalt cobalto o nichel. Con i metodi basati su Ni, l’efficienza di lavaggio può essere migliorata con l’aggiunta di 20 mm di imidazolo (le proteine sono solitamente eluite con 150-300 mm di imidazolo). Generalmente, le resine a base di nichel hanno una maggiore capacità legante, mentre le resine a base di cobalto offrono la massima purezza. La purezza e la quantità di proteine possono essere valutate da SDS-PAGE e Western blotting.
La purificazione di affinità facendo uso di un polihistidine-tag provoca solitamente la proteina relativamente pura quando la proteina ricombinante è espressa in organismi procarioti. A seconda delle applicazioni a valle, compresa la purificazione di complessi proteici per studiare le interazioni proteiche, la purificazione da organismi superiori come lieviti o altri eucarioti può richiedere una purificazione di affinità in tandem utilizzando due tag per produrre una purezza più elevata. In alternativa, la purificazione in un solo passaggio utilizzando ioni di cobalto immobilizzati piuttosto che ioni di nichel produce generalmente un sostanziale aumento della purezza e richiede concentrazioni di imidazolo inferiori per l’eluizione della proteina con tag his.
La Polyhistidine-tagging è l’opzione di scelta per la purificazione delle proteine ricombinanti nelle circostanze denaturanti perché il suo modo di azione dipende soltanto dalla struttura primaria delle proteine. Ad esempio, anche quando una proteina ricombinante forzatamente espressa in E. coli produce un corpo di inclusione e non può essere ottenuto come proteina solubile, può essere purificato con denaturazione con urea o guanidina cloridrato. Generalmente, per questo genere di tecnica, il legame dell’istidina è titolato facendo uso di pH invece del legame dell’imidazolo-ad un alto pH, l’istidina lega al nichel o al cobalto, ma al pH basso (~6 per cobalto e ~4 per nichel), l’istidina diventa protonata ed è competuta fuori dello ion del metallo. Confrontalo con la purificazione degli anticorpi e la purificazione GST, un prerequisito al quale è il corretto ripiegamento (nativo) delle proteine coinvolte. D’altra parte, si dice che il tag His tende ad aggregare e insolubilizzare più di altri tag di affinità.
Le colonne di Polyhistidine-tag mantengono diverse proteine ben note come impurità. Uno di questi è l’isomerasi peptidil prolil di tipo FKBP, che appare intorno a 25kDa (SlyD). Le impurità vengono generalmente eliminate utilizzando una tecnica cromatografica secondaria o esprimendo la proteina ricombinante in un ceppo di E. coli carente di SlyD. In alternativa, il confronto con le resine a base di nichel e cobalto ha meno affinità con SlyD di E. coli, ma in diversi casi è moderatamente utile.
Separare uno da due tag di poliistidina
Le proteine con un numero diverso di tag di poliistidina eluiscono in modo diverso dalla resina ad affinità di nichel. Per le proteine con una singola etichetta dell’esaistidina, l’imidazolo di 75 millimetri permette l’eluizione da Ni-NTA, mentre per le proteine con due etichette dell’esaistidina, l’imidazolo di 100 millimetri è richiesto per l’eluizione. Questa eluizione graduale può essere utilizzata per isolare specifici gruppi proteici da una miscela, come gli eteromultimeri definiti (ad esempio un eterodimero AB da una miscela che include gli omodimeri AA e BB, se solo la subunità B ha un tag di poliistidina). Tale approccio è stato utilizzato in isolamento di streptavidina monovalente.
Binding assaysEdit
Polyhistidine-tagging può essere utilizzato per rilevare le interazioni proteina-proteina nello stesso modo di un test pull-down. Tuttavia, questa tecnica è generalmente considerata meno sensibile e anche limitata da alcuni degli aspetti più schizzinosi di questa tecnica. Ad esempio, le condizioni di riduzione non possono essere utilizzate, l’EDTA e molti tipi di detergenti non possono essere utilizzati. I recenti progressi nell’interferometria a doppia polarizzazione sono suscettibili di EDTA e un uso più ampio di reagenti, e l’uso di tali tag site-specific semplifica enormemente la misurazione diretta del cambiamento conformazionale associato.
Hexahistadine CyDye tag sono stati sviluppati anche. Questi usano la coordinazione covalente del nichel ai gruppi EDTA attaccati ai fluorofori per creare coloranti che si attaccano al tag di poliistidina. Questa tecnica ha dimostrato di essere efficace per seguire la migrazione e il traffico di proteine. Ci sono state anche recenti scoperte che mostrano che questa tecnica può essere efficace per misurare la distanza tramite il trasferimento di energia di risonanza fluorescente.
Un tag polifluorohistidine è stato segnalato per l’uso in sistemi di traduzione in vitro. In questo sistema viene utilizzato un codice genetico espanso in cui l’istidina viene sostituita dalla 4-fluoroistidina. L’analogo fluorurato è incorporato nei peptidi attraverso la specificità del substrato rilassato dell’istidina-tRNA ligasi e abbassa il pKa complessivo del tag. Ciò tiene conto l’arricchimento selettivo dei peptidi etichettati polifluoroistidina in presenza di miscele complesse delle etichette tradizionali della poliistidina alterando il pH dei tamponi del lavaggio.
