Il sequenziamento N-terminale, spesso indicato come sequenziamento di Edman o degradazione di Edman è una tecnica importante nello studio delle proteine e rimane un approccio unico che può produrre nuovi dati di sequenza proteica. È inoltre la tecnica preferita per la conferma rapida di espressione della proteina.
La chimica di questo approccio è stata introdotta per la prima volta nel 1950 da P. Edman dell’Università di Lund in Svezia e ulteriormente sviluppata durante il suo lavoro a Melbourne, in Australia, a quello che si ritiene essere il primo dispositivo di sequenziamento peptidico automatizzato.
Chimica di Edman
Figura 1. Chimica di degradazione di Edman per il sequenziamento delle proteine N-terminali.
Le reazioni chimiche che producono l’amminoacido marcato con N-terminale idrolizzato sono mostrate in fig 1. Ogni ciclo comprende essenzialmente 3 passaggi:
- Accoppiamento del fenilisotiocianato (PITC, reagente di Edman) all’alfa-ammina della catena polipeptidica in condizioni di base per formare una frazione di feniltiocarbamile (PTC).
- La scissione in condizioni acide lievi genera un terminale amminico libero sul polipeptide e un aminoacido addotto anilinotiazolinone (ATZ).
- Quest’ultimo viene estratto e ulteriormente convertito in un derivato della feniltioidantoina (PTH) più stabile.
Il residuo PTH risultante viene analizzato mediante HPLC e tempi di ritenzione rispetto a quello degli aminoacidi standard PTH.
Reazioni collaterali e sottoprodotti
La chimica del ciclo di sequenziamento e il lavoro sono ben controllati e producono specie perfettamente definite, ci sono alcuni sottoprodotti che vengono rilevati durante l’analisi.
Come mostrato in figura 2, provengono principalmente dall’idrolisi di PITC e dalla metanolisi durante il ciclo e includono difeniltiourea (DPTU), N-fenile,O-metil-tiocarbonato (PMTC) e difenilurea (DPU), sottoprodotti che coestraggono e co-eluiscono con gli amminoacidi PTH.
