In una stanza buia a Ashburn, Virginia, file di scienziati siedono a schermi di computer che visualizzano vivaci forme 3-D. Con un clic del mouse, girano ogni forma per esaminarla da tutti i lati. Gli scienziati stanno lavorando all’interno di un edificio di cemento presso il campus di ricerca Janelia dell’Howard Hughes Medical Institute, appena fuori da una strada chiamata Helix Drive. Ma le loro menti sono da qualche altra parte interamente-all’interno del cervello di una mosca.
Ogni forma sugli schermi degli scienziati rappresenta parte di un neurone della mosca della frutta. Questi ricercatori e altri di Janelia stanno affrontando un obiettivo che una volta sembrava fuori portata: delineare ciascuno dei circa 100.000 neuroni del cervello della mosca e individuare i milioni di luoghi che collegano. Tale schema elettrico, o connectome, rivela i circuiti completi di diverse aree cerebrali e come sono collegati. Il lavoro potrebbe aiutare a sbloccare le reti coinvolte nella formazione della memoria, per esempio, o percorsi neurali che sono alla base dei movimenti.
Gerry Rubin, vice presidente di HHMI e direttore esecutivo di Janelia, ha sostenuto questo progetto per più di un decennio. È un passo necessario per capire come funziona il cervello, dice. Quando il progetto è iniziato, Rubin ha stimato che con i metodi disponibili, tracciando le connessioni tra ogni neurone mosca a mano avrebbe preso 250 persone che lavorano per due decenni – quello che si riferisce a come ” un problema di 5.000 persona-anno.”
Ora, un flusso di progressi nella tecnologia di imaging e algoritmi di deep-learning hanno strappato il sogno di un connectome mosca fuori dalle nuvole e nel regno della probabilità. Microscopi personalizzati ad alta potenza, un team di correttori di bozze neurali dedicati e analisti di dati e una partnership con Google hanno accelerato il processo di ordini di grandezza.
Oggi, un team di ricercatori di Janelia riferisce di aver raggiunto un traguardo critico: hanno tracciato il percorso di ogni neurone in una porzione del cervello femminile della mosca della frutta che hanno soprannominato “emibrain.”La mappa comprende 25.000 neuroni-circa un terzo del cervello della mosca, in volume-ma il suo impatto è fuori misura. Include regioni di vivo interesse per gli scienziati, quelle che controllano funzioni come l’apprendimento, la memoria, l’olfatto e la navigazione. Con più di 20 milioni di connessioni neurali individuate finora, è la mappa più grande e dettagliata del cervello della mosca mai completata.
Il team di progetto connectome, noto come FlyEM, sta rendendo i dati — e tutti gli strumenti necessari per utilizzarli — disponibili gratuitamente. Descrivono il lavoro in un documento pubblicato su bioRxiv il 21 gennaio 2020. E sono attualmente sulla buona strada per completare un connettoma dell’intero sistema nervoso fly entro il 2022.
“Questa è stata una grande scommessa su qualcosa che la gente pensava fosse quasi impossibile da fare”, afferma Viren Jain, ricercatore di Google ed ex capo laboratorio di Janelia. “Questa sarà la prima volta che possiamo davvero avere uno sguardo sfumato all’organizzazione di un sistema nervoso con 100.000 neuroni su scala sinaptica.”
Con una mappa neurale dettagliata in mano, gli scienziati saranno in grado di rispondere a domande su come il cervello funziona più velocemente che mai. “Questo cambierà il modo in cui le persone fanno neuroscienze”, dice Rubin.
Un progetto del cervello
Ad oggi, solo un organismo ha avuto il suo connettoma completo mappato — Caenorhabditis elegans, un piccolo verme trasparente con solo 302 neuroni e circa 7.000 connessioni neurali. Gli scienziati hanno rasato nastri di tessuto usando un coltello diamantato, catturato immagini con un microscopio elettronico e poi tracciato il percorso di ogni neurone nel sistema nervoso del verme — a mano.
Il lavoro ha richiesto un’attenzione minuziosa ai dettagli. Ma i neuroni worm non sono così numerosi come quelli di mosche, topi o persone – e tendono a fare meno connessioni. Districare i viticci che serpeggiano attraverso il cervello di animali più grandi è monumentalmente più difficile. Progetti Connectome su cervelli più complessi hanno affrontato una piccola parte del cervello in grande dettaglio, o hanno mappato i neuroni in tutto un intero cervello, ma catturato solo una frazione delle cellule.
Per quanto piccolo possa apparire il cervello della mosca-ha le dimensioni di un seme di papavero – mappare i suoi 100.000 neuroni in dettagli squisiti è una sfida su un livello completamente nuovo. Quindici anni fa, “molti neurobiologi erano scettici sul valore di avere questo tipo di dati sul cervello”, soprattutto in considerazione di quanto sarebbe laborioso raccogliere, dice Jain.
In primo luogo, i ricercatori devono convincere immagini cerebrali ad alta risoluzione da potenti microscopi. Quindi devono mappare i ringhi neurali che si dispiegano attraverso entrambi gli emisferi, per ogni neurone. Come sequenziamento del genoma umano, ottenere il lavoro fatto non poggiava su una svolta scientifica, Rubin dice, ma piuttosto su innovazione tecnologica e logistica umana.
Per lui, è stata una sfida valida. “Sono stato motivato dagli scettici”, dice. “Sapevamo che dovevamo rendere il processo più di 100 volte più efficiente, ma questo è esattamente il tipo di progetto che Janelia è stata creata per realizzare”, aggiunge Rubin.
Il primo ostacolo: ottenere una visione chiara e nitida di ogni neurone che serpeggia attraverso il cervello della mosca.
Istantanee neurali
Dietro diverse serie di porte chiuse e tende bianche a pavimento, otto microscopi pesanti sono pronti per l’immagine del cervello di una mosca. In questa stanza silenziosa, nulla interferisce con la raccolta di immagini. Harald Hess, C. Shan Xu, e i loro colleghi hanno preparato questi microscopi per tutto, ma l’apocalisse.
” Noi lo chiamiamo ‘Atto di stanza a prova di Dio’, ” dice Hess, un leader di gruppo senior a Janelia.
I microscopi poggiano su cuscinetti d’aria gonfiati per ridurre al minimo le vibrazioni. Anche la stanza stessa è stata costruita per smorzare il rumore; si trova sulla propria lastra di cemento, separata dal resto dell’edificio.
Questi microscopi sono stati originariamente progettati per acquisire dati nell’arco di minuti o ore. Ma per immaginare l’intero cervello della mosca, un ambito deve funzionare continuamente per mesi o anni. Un singolo gap nei dati può buttare tutto fuori, Hess dice. “Deve essere davvero perfetto.”Quindi il suo team ha trascorso quasi un decennio a mettere a punto ogni parte del processo di raccolta delle immagini, descritto in un articolo bioRxiv di novembre 2019. I microscopi possono ora sfornare immagini costantemente nitide, rivelando il labirinto di neuroni del cervello in dettagli intricati. Se qualcosa non funziona correttamente, gli ambiti mettono automaticamente in pausa la raccolta dei dati e inviano un SOS.
Hess, Xu e i loro colleghi usano una tecnica chiamata microscopia elettronica a scansione a fascio di ioni focalizzati o FIB-SEM. Lo scopo usa un fascio messo a fuoco dello ion per macinare via gli incrementi fini del tessuto cerebrale della mosca, come una sabbiatrice molto precisa. Spara ioni di gallio su un pezzo di tessuto, lucidando la superficie atomo per atomo. Il microscopio scatta un’immagine della superficie del tessuto, lucida fuori un altro strato sottile, e scatta un’altra immagine – più e più volte fino a quando l’intero campione è macinato via. Mentre il campione fisico scompare lentamente, il suo gemello digitale viene memorizzato per sempre, pezzo per pezzo.
Quindi, i programmi per computer allineano queste immagini e le ricuciscono insieme per creare una rappresentazione 3D del cervello della mosca.
Per immaginare l’emibrain della Drosophila, i ricercatori hanno tagliato un cervello di mosca in lastre, imaged ciascuno con un microscopio elettronico, poi cucito tutte le immagini insieme. L’obiettivo: creare un volume di immagine che consenta agli scienziati di tracciare il percorso di ciascun neurone attraverso il cervello.
Le immagini utilizzate per lo schema elettrico – tutte da una singola mosca femmina – sono già state raccolte. Ma gli ambiti sono ancora in esecuzione forte: ora stanno raccogliendo dati dal cervello di una mosca maschio. Questa volta, l’obiettivo è catturare l’intero sistema nervoso centrale. Se tutto va senza intoppi, gli ambiti finiranno quell’attività entro la fine del 2020.
La memorizzazione di immagini da un singolo cervello fly richiederebbe circa 100 terabyte su un disco rigido. Questo è all’incirca l’equivalente di 100 milioni di foto sul tuo computer, afferma Steve Plaza, leader del team del progetto FlyEM. Sono troppi dati per gli esseri umani da pettinare a mano-le strategie che hanno lavorato su C. elegans sono insufficienti. Così i ricercatori hanno trovato modi per accelerare il processo, computer di formazione per fare il lavoro automaticamente.
Collaborando con un gigante tecnologico
I computer possono eseguire tutti i tipi di attività relative alle immagini, come riconoscere i volti o individuare le strade nelle immagini satellitari. Questi compiti si basano, in parte, su un processo chiamato segmentazione dell’immagine: suddividere un’immagine digitale nei suoi pezzi costitutivi e etichettarli ciascuno.
Per anni, Google ha sperimentato modi per migliorare questo processo. Jain ei suoi colleghi volevano costruire la tecnologia di segmentazione e applicarla a un problema impegnativo. Analizzando le immagini dei neuroni misura il disegno di legge. Ma insegnare a un algoritmo come scegliere in modo affidabile, o segmentare, i neuroni nelle immagini, richiede molti esempi di allenamento. Quindi, Jain ha contattato il team FlyEM di Janelia, che stava sfornando dati più velocemente di quanto potessero analizzarli. I due gruppi hanno iniziato la condivisione dei dati e il monitoraggio di quanto bene gli algoritmi di Google stavano seguendo le fibre neurali attraverso strati di dati di imaging.
“Google ha fornito un sacco di potenza intellettuale e un sacco di potenza computazionale,” Rubin dice-avevano la tecnologia più recente, e le risorse da dedicare a testare algoritmi su enormi set di dati. “È stata una collaborazione ideale-team che avevano diverse competenze che lavoravano insieme.”
Idealmente, Jain dice, i computer potrebbero solo scegliere i neuroni direttamente dalle immagini del microscopio. Ma questo è difficile da fare, perché molti neuroni si estendono su grandi fasce del cervello, coprendo molte immagini. In passato, gli algoritmi hanno adottato un approccio frammentario. In primo luogo, un algoritmo informatico identifica i confini cellulari che separano i neuroni da tutto il resto nel cervello. Quindi, un altro algoritmo colora all’interno di quei confini, definendo ogni sezione come un pezzo di neurone. Infine, un terzo algoritmo collega tutti i pezzi neurali insieme, formando un progetto del percorso aggrovigliato di ciascun neurone.
Gli algoritmi di Google scartano tutti quei passaggi, tracciando i neuroni in modo più organico-come un essere umano. Un algoritmo, chiamato una rete di riempimento delle inondazioni, segue direttamente i viticci neurali end-to-end mentre scorre attraverso i dati di imaging, dice Jain. Prende decisioni su come estendere la forma di un neurone in base al contesto dell’immagine e alle sue previsioni precedenti. Jain ei suoi colleghi di Google descrivono il lavoro 22 gennaio 2020, in un post sul blog di Google AI.
Per aiutare il programma imparare, il team ha alimentato completamente-tracciato, neuroni umani-validati, dice Michal Januszewski, un ricercatore di Google che lavora al progetto. Che dà l’esperienza algoritmo interpretando vari tipi e forme di neuroni, da tutto il cervello. “Speriamo che nel tempo impari a correggere gli errori che in origine dovevano essere corretti a mano”, dice.
Man mano che l’algoritmo migliora, il carico di lavoro umano diminuisce. Lavorare con Google ha reso il progetto andare più di 10 volte più veloce, Rubin stima.
Full steam ahead
Nonostante il successo dell’algoritmo, i computer non ottengono l’ultima parola. Torna a Janelia, decine di correttori di bozze umani poro sopra i dati, alle scrivanie affollate di monitor a grande schermo. Questi tecnici cercano luoghi in cui l’algoritmo ha erroneamente unito rami neurali appartenenti a neuroni diversi o erroneamente diviso un ramo a parte.
“C’è ancora molto sforzo manuale richiesto”, afferma Ruchi Parekh, che guida un team di tracciatori di neuroni e correttori di bozze. Negli ultimi quattro anni, il suo team è cresciuto fino a quasi 50 persone, per tenere il passo con i dati segmentati che Google sta inviando indietro a tassi sempre più veloci. Un altro team, guidato da Pat Rivlin, valuta e verifica continuamente nuove tecnologie per rendere il processo di correzione delle bozze più efficiente e accurato. Ma il lavoro scrupoloso richiede ancora un’enorme pazienza. I correttori di bozze scorrono strati di dati di imaging, scrutando i punti di connessione proposti da più angolazioni per determinare se i due neuroni comunicano davvero.
Quando si tratta di tracciare i neuroni, gli esseri umani sono ancora meglio di algoritmi in molti modi, dice Plaza. Gli esseri umani hanno la conoscenza generale e la consapevolezza che consente loro di individuare stranezze nei dati, spiega. “Fondamentalmente, gli esseri umani hanno buon senso.”
Ad esempio, grandi errori di connessione sono solitamente evidenti all’occhio umano. Quindi i correttori di bozze possono scansionare rapidamente grandi blocchi di dati, alla ricerca di neuroni drammaticamente deformi. Quando individuano qualcosa che sembra sbagliato, possono indagare in modo più dettagliato.
L’obiettivo finale del team è quello di creare una risorsa utile ad altri scienziati. Ciò ha significato pensare anche a come i dati vengono archiviati e presentati. Plaza ei suoi colleghi hanno costruito programmi per rendere spulciando attraverso il set di dati più accessibile. “Abbiamo un set di dati davvero grande: è molto da capire per chiunque”, afferma. “Avere uno strumento che consente di scomporre i dati in unità interpretabili è la chiave.”Ora gli scienziati interessati a un neurone specifico possono scoprire come appare e a quali cellule si connette – e quali altri neuroni hanno qualità simili e potrebbero essere correlati.
Plaza e il suo team continueranno a perfezionare il loro connectome e pubblicare versioni aggiornate. I ricercatori interessati a come i neuroni in queste regioni già mappate si connettono al resto del cervello dovranno aspettare un paio d’anni per completare il connectome completo. Ma i dati attuali stanno già rivelando intuizioni e aprendo nuove domande.
Una grande domanda per gli scienziati ora è ” Come analizzi il connectome e poi dai un senso a ciò che stai vedendo?”Parekh dice. “I dati sono lì. Cosa ne fai?”
Per Rubin, che si dimetterà da direttore esecutivo di Janelia a fine mese e tornerà a tempo pieno al suo laboratorio Janelia, questa pietra miliare è solo l’inizio. “È soddisfacente vederlo avere successo-è il risultato scientifico di cui sono più orgoglioso dal mio tempo come direttore, in parte perché ha richiesto contributi complementari da così tante persone di talento che lavorano insieme per oltre un decennio”, afferma. “Ma personalmente, sono interessato a usare questa conoscenza per imparare come funziona il cervello.”
Citazione
C. Shan Xu et al. “Un connettoma del cervello centrale della Drosophila adulta.”Pubblicato il bioRxiv.org il 21 gennaio 2020. doi:10.1101 / 2020.01.21.911859
