Vitamina D e acidi grassi omega-3 i supplementi di bambini con disturbo dello spettro autistico: un protocollo di studio per un fattoriale randomizzato, in doppio-cieco, placebo-controlled trial

Questo studio si compone di due fasi: fase 1 includerà reclutamento e selezione, mentre la fase 2 è una vitamina D e n-3 LCPUFA randomizzato, in doppio-cieco, placebo-controlled trial (Fig. 1). La durata dell’intervento è di 12 mesi.

Schema schematico del disegno di studio. 1 Biomarcatori del sangue: 25-idrossivitamina D (25(OH)D), globuli rossi (RBC) acidi grassi, calcio, albumina, studi sul ferro, vitamina B12, folato, emocromo completo e vitamina A. Questionari: sociodemografia, anamnesi, comportamenti alimentari/durante i pasti e diario alimentare. 2Questionnaires: funzionamento sociocomunicativo, problemi sensoriali e comportamenti aberranti (risultati primari); sintomi gastrointestinali (esito secondario), esposizione al sole e colore della pelle. Antropometria: peso e altezza. 3 Biomarcatori del sangue: 25 (OH)D, acidi grassi RBC, calcio e albumina. Questionari: funzionamento sociocomunicativo, problemi sensoriali, comportamenti aberranti (risultati primari) e comportamenti alimentari/durante i pasti e qualità della dieta. Antropometria: peso e altezza. 4 Biomarcatori del sangue: 25 (OH) D, calcio e albumina. *Sintomi gastrointestinali (outcome secondario) e farmaco/integratore uso/incidenza di eventi avversi/supplemento conformità sarà monitorata durante il periodo di studio

Fase 1 sarà l’occasione per una completa descrizione della popolazione in studio con il rispetto per lo stato nutrizionale (indici biochimici e apporto con la dieta), la demografia e la storia medica. La fase 2 dimostrerà l’efficacia della supplementazione con vitamina D, n-3 LCPUFAs o entrambi sulla riduzione dei sintomi di ASD.

Partecipanti

Questo studio è una collaborazione tra Massey University e il Waitemata District Health Board (WDHB), Nuova Zelanda. I caregiver dei bambini che soddisfano i criteri per lo studio saranno affrontati in prima istanza dai coordinatori dello sviluppo WDHB.

Abbiamo calcolato che 42 partecipanti (un minimo di 34 partecipanti, e consentendo un tasso di abbandono potenziale del 20%) sarebbero necessari per ogni braccio dello studio per dimostrare una differenza clinicamente significativa a 80% di potenza e 5% di significatività statistica. I calcoli di potenza erano basati su una differenza di 17 unità tra gruppi integrati e placebo nel cambiamento dal basale all’endpoint sul punteggio totale della scala di risposta sociale (SRS), su un SRS medio e una deviazione standard di 105 e 24,7 unità nei bambini non trattati con ASD, rispettivamente (dal nostro studio pilota 2015, inedito). La dimensione del campione è stata calcolata utilizzando la formula seguente :

dove N è la dimensione del campione richiesta per gruppo, α è la SD, K è la costante (7.9 denota l ‘ 80% di potenza e il 5% di significatività) e (μ2 − μ1) è la differenza nel punteggio totale SRS tra i gruppi.

Per garantire che lo studio sia adeguatamente alimentato, un’analisi provvisoria in cieco a > 50% dell’iscrizione inizialmente pianificata sarà eseguita da una terza parte indipendente per stimare la varianza per un potenziale aumento della dimensione del campione.

Criteri di inclusione ed esclusione

I bambini avranno diritto a questo studio se hanno un’età compresa tra 2 anni.5 e 8 anni, hanno una diagnosi medica di ASD confermata sia da un pediatra dello sviluppo in conformità con i criteri elencati nel Manuale diagnostico e statistico dei disturbi mentali, versione cinque (DSM-5), e l’insorgenza dei sintomi dopo 18 mesi di età. Il limite inferiore di 2,5 anni è stato scelto in base ai criteri di età degli strumenti di valutazione psicologica e il limite superiore di 8 anni è stato scelto per evitare l’effetto confondente dei cambiamenti comportamentali associati allo stadio puberale. La competenza del caregiver in inglese è un requisito (a causa della natura degli strumenti di valutazione dei risultati). I volontari sono esclusi se sono stati diagnosticati come con ritardo dello sviluppo dalla nascita.

Ulteriori criteri di inclusione per lo studio sono: funzionalità epatica nell’intervallo normale(albumina 34-48 g/L) e siero 25 (OH)D <75 + 10 nmol/L se entrano nello studio in inverno e <105 nmol/L + 10 nmol/L se entrano nello studio in estate. È stata scelta una variazione di 10-nmol / L a causa della potenziale variabilità del dosaggio . Abbiamo applicato due diversi punti di cut-off per l’esclusione perché c’è una grande variazione stagionale nelle concentrazioni sieriche di 25(OH)D in Nuova Zelanda che vanno da 30 nmol/L a 44 nmol/L .

Impostazione

Lo studio si svolgerà ad Auckland, Nuova Zelanda. Campioni di sangue non digiunati saranno raccolti presso gli ospedali North Shore o Waitakere di Auckland, Nuova Zelanda. Questionari e antropometria saranno effettuati presso la Massey University, Auckland, Nuova Zelanda. Auckland è la città più grande della Nuova Zelanda con una popolazione di poco più di un milione. È stato stimato che circa 13.000 (32,5%) individui con ASD risiedono nella regione di Auckland maggiore .

Fase 1 – screening

Lo screening e il reclutamento (fase 1 dello studio) si svolgeranno su un periodo di 24 mesi, iniziato a gennaio 2015. I bambini che soddisfano i criteri di inclusione iniziale avranno un prelievo di sangue e saranno sottoposti a screening per carenze nutrizionali. Vedere le tabelle 1 e 2 per le misure di esito, i metodi di prova e il calendario di iscrizione, intervento e valutazione, rispettivamente.

Pre-preparazione dell’intervento

Prima della randomizzazione e l’inclusione nella prova, vitamina D, ferro e vitamina B12 carenze saranno affrontati. Fare riferimento alla Tabella 3 per un elenco delle carenze nutrizionali e delle strategie di gestione applicate in questo studio.

Fase 2 – vitamina D e n-3 LCPUFA intervento

L’intervento consiste di 2000 UI di vitamina D3 al giorno, 722 mg di DHA al giorno, di 2000 UI di vitamina D3 plus 722 mg di DHA al giorno o placebo, in forma di quattro capsule orali. I materiali di trattamento saranno consegnati in capsule di gel da 750 mg con un ugello a strappo prodotto e fornito da Douglas Nutrition Ltd., Auckland, Nuova Zelanda. Le capsule dello studio, vitamina D, n-3 LCPUFAs e placebo sono identiche nell’aspetto e sono tutte insipide e incolori. Il bambino è tenuto a consumare il contenuto di quattro capsule al giorno mescolate nel loro cibo di preferenza o per somministrazione orale con siringa. Fare riferimento alla Tabella 4 per la dose giornaliera totale e il contenuto di ciascuna capsula. Durante tutto il periodo di studio, i bambini sono autorizzati ad avere qualsiasi terapia o farmaco per l’autismo e qualsiasi integratore a condizione che non contenga vitamina D o omega-3.

la Supplementazione con 2000 UI di vitamina D3 ha dimostrato di essere un sicuro dosi nei neonati , e la Società francese di Pediatria raccomanda 1000 a 1200 UI al giorno nei bambini allattati al seno . La massa corporea dei bambini di 2,5–8 anni nel nostro studio sarà notevolmente maggiore di quella dei neonati, il che dovrebbe ridurre ulteriormente il rischio di eventi avversi. Inoltre, 2000 UI al giorno è inferiore al limite superiore sicuro di 2500 e 3000 UI/die suggerito dall’IOM per i gruppi di età di 1-3 e 4-8 anni, rispettivamente .

La dose di DHA di 722 mg/die è fisiologicamente rilevante e ottenibile attraverso la dieta (equivalente a circa tre porzioni di pesce grasso alla settimana) ed è paragonabile alle dosi utilizzate in altri studi su bambini che studiano gli effetti degli LCPUFA n-3 sul comportamento e sull’apprendimento . Non sono stati riportati effetti indesiderati nei bambini con una dose di 600 mg DHA / die .

Randomizzazione, accecamento e allocazione nascosta

I bambini saranno assegnati in modo casuale a uno dei quattro gruppi, essendo stati stratificati per età e gravità della ASD. La randomizzazione delle capsule attive/placebo, la lista delle sequenze randomizzate e l’assegnazione del gruppo saranno completamente nascoste ai ricercatori, ai bambini e agli operatori sanitari per l’intero studio, inclusa l’analisi dei dati. Una terza parte non coinvolta in alcun aspetto dello studio genererà un design a blocchi casuali in blocchi di quattro e otto utilizzando Randomization.com (http://www.randomization.com/). La terza parte assegnerà un codice di trattamento a un bambino una volta confermata la loro idoneità all’intervento e ricevuto il consenso del caregiver. In una situazione di emergenza in cui sarà richiesta la rottura del cieco dello studio, saranno in atto piani per lo sperimentatore principale di contattare la terza parte responsabile della randomizzazione per rivelare l’assegnazione del trattamento per un determinato partecipante.

Raccolta dati

I partecipanti (caregivers e bambini) frequenteranno l’Unità di ricerca sulla nutrizione umana (HNRU) presso la Massey University in due occasioni: basale e 12 mesi. Una volta reclutati nella fase 2 e prima di ricevere una fornitura di 4 mesi di integratori, i caregiver completeranno alcuni questionari sui sintomi principali di ASD (funzionamento sociocomunicativo e problemi sensoriali) e comportamenti aberranti come misure di esito primario dello studio e sui sintomi gastrointestinali come misura di esito secondario. Una volta completato l’intervento (12 mesi), le valutazioni di base dei sintomi principali di ASD e dei comportamenti aberranti completati dai caregivers saranno ripetute. Gli operatori sanitari completeranno anche i diari settimanali dei sintomi gastrointestinali durante il periodo di studio.

Saranno raccolte ulteriori informazioni per descrivere le caratteristiche della popolazione dello studio al basale. Queste informazioni includono comportamenti alimentari/durante i pasti, diari alimentari, esposizione al sole, colore della pelle e antropometria (peso e altezza). Alla visita finale, verrà ripetuta la valutazione di base dei comportamenti alimentari/durante i pasti e verrà misurato il peso/altezza dei bambini. Fare riferimento alla Tabella 1 per le misure di esito e i metodi di prova.

Prelievo e analisi del sangue

I bambini saranno sottoposti a prelievo di campioni di sangue in tre occasioni: basale (fase 1 – screening), 6 mesi (misure di sicurezza) e 12 mesi (endpoint). Fare riferimento alla Tabella 1 per i biomarcatori nutrizionali e i metodi di prova. I campioni di sangue non digiunati saranno raccolti sotto la supervisione del personale pediatrico e trattati presso gli ospedali North Shore o Waitakere del servizio di laboratorio WDHB. I biomarcatori nutrizionali saranno analizzati da un campione di sangue venoso. Questi includono quanto segue: 25 (OH)D, acidi grassi RBC, calcio, albumina, studi sul ferro, vitamina B12 e folato, emocromo completo e vitamina A. Ad eccezione degli acidi grassi RBC e della vitamina A, tutti i biomarcatori saranno analizzati al North Shore Hospital. Gli acidi grassi RBC saranno analizzati presso l’Università di Wollongong, NSW, Australia, e la vitamina A in un laboratorio presso la Massey University, Auckland, Nuova Zelanda.

Questionari

Le misure di risultato primario sono valutazioni psicologiche dei sintomi principali di ASD e dei comportamenti problematici concomitanti che sono dettagliati nella Tabella 1. La misura del risultato secondario è la valutazione dei problemi gastrointestinali. Saranno fornite istruzioni standardizzate a tutti gli operatori sanitari su come compilare i questionari durante la loro visita all’HNRU. Prima che il partecipante parta, i ricercatori dell’HNRU controllano tutte le risposte per completezza.

Social Responsiveness Scale™, Seconda edizione (SRS-2) : verranno utilizzate le versioni SRS-2 specifiche per i gruppi di età da 2,5 a 4,5 e da 4,5 a 18 anni. SRS-2 identifica la compromissione sociale associata all’ASD e quantifica la sua gravità nei domini della consapevolezza sociale, dell’elaborazione delle informazioni sociali, della comunicazione sociale reciproca, dell’ansia/evitamento sociale e del comportamento stereotipato/interessi limitati . La validità clinica e la sensibilità di SRS-2 sono state determinate in popolazioni con ASD .

Sensory Processing Measures™ (SPM): verranno utilizzate le versioni SPM specifiche per i gruppi di età 2-5 e 5-12 anni. SPM valuta l’elaborazione sensoriale, la pianificazione e le idee (prassi) e la partecipazione sociale nei bambini. Le scale misurano la partecipazione sociale, la visione, l’udito, il tatto, la consapevolezza del corpo (propriocezione), l’equilibrio e il movimento (funzione vestibolare) e la pianificazione e le idee (prassi) . Questo strumento è stato standardizzato, convalidato e utilizzato nei bambini con ASD .

Aberrant Behavior Checklist (ABC) : l’ABC misura la varietà di problemi comportamentali, ovvero irritabilità, astinenza sociale, comportamento stereotipato, iperattività e linguaggio inappropriato . È stato convalidato nei bambini con ASD ed è stato ampiamente utilizzato negli studi di esito del trattamento di ASD .

Questionario sui sintomi gastrointestinali: il questionario sui sintomi gastrointestinali è stato progettato specificamente per questo studio e include segni e sintomi gastrointestinali più comunemente riportati nei bambini con ASD . Agli assistenti dei partecipanti allo studio verranno forniti diari online settimanali e verrà chiesto di registrare se il bambino ha avuto stitichezza, diarrea, flatulenza, dolore addominale, vomito/nausea, distensione addominale, irritabilità diurna inspiegabile o/e risveglio notturno inspiegabile durante la settimana passata, e in caso affermativo quante volte si sono verificati. Il questionario sui sintomi gastrointestinali non è stato convalidato, ma include domande sui sintomi gastrointestinali più ampiamente riportati nelle popolazioni di ASD, o comportamenti che potrebbero essere una conseguenza dei sintomi gastrointestinali. Non siamo a conoscenza di uno strumento convalidato per valutare i sintomi gastrointestinali nei bambini autistici, e certamente non in Nuova Zelanda.

Indice dietetico del consumo dei bambini (DADI): il DICE è un semplice strumento di valutazione della qualità della dieta che è stato sviluppato dal team di ricerca, basato sulle linee guida del Ministero della Salute e della nutrizione della Nuova Zelanda per bambini e giovani sani . Questo strumento è stato convalidato in una coorte di bambini sani della Nuova Zelanda di età compresa tra 2 e 8 anni (non pubblicati) e sarà convalidato nei bambini ASD in questo studio contro il diario alimentare stimato di 4 giorni e i marcatori biochimici.

Behavioural Pediatrics Feeding Assessment Scale (BPFAS): il BPFA è un semplice strumento di valutazione che misura il comportamento di un bambino durante i pasti e gli atteggiamenti e i comportamenti dei genitori. Si tratta di un questionario in scala di 35 elementi che comprende 25 domande in scala likert (5 punti) sul comportamento dei bambini e 10 domande dicotomiche sugli atteggiamenti e sui comportamenti dei genitori. I punteggi di cut-off per i BPFA sono stati recentemente stabiliti . Il BPFAS è il questionario d’alimentazione genitore-amministrato più affidabile, con la buona validità interna e l’affidabilità della prova-ripetizione .

Diario alimentare stimato di quattro giorni: i dati di assunzione alimentare saranno raccolti da un diario alimentare stimato di 4 giorni, incluso un giorno del fine settimana. Le istruzioni su come completare con precisione il diario alimentare saranno fornite con il diario alimentare. Ai partecipanti verrà consegnata una busta pre-indirizzata gratuita per la restituzione del libretto. L’assunzione media di macro e micronutrienti sarà valutata in quattro giorni riportati utilizzando FoodWorks Professional Edition 7 (Software Xryis, Brisbane, QLD, Australia, 2012).

Nel presente studio, è stato scelto un diario alimentare di 4 giorni a causa dell’elevato carico degli intervistati e delle caratteristiche che richiedono tempo di diari alimentari più lunghi come un diario alimentare di 7 giorni. A causa dell’elevata variazione all’interno della persona nelle assunzioni di nutrienti, si raccomanda di registrare le assunzioni dietetiche per un periodo di tempo più lungo per avere una stima altamente accurata dell’assunzione. Tuttavia, se un diario alimentare di 4 giorni copre giorni diversi in modo casuale, può fornire stime accurate dell’assunzione dietetica .

Le informazioni riguardanti l’esposizione al sole e il colore della pelle, gli integratori alimentari e gli eventuali regimi dietetici speciali seguiti saranno raccolte mediante questionari appositamente progettati per lo scopo del presente studio. Il questionario sull’esposizione al sole include una domanda sulle credenze e gli atteggiamenti del caregiver nei confronti dell’esposizione al sole, nonché domande sul paese e sulla città di residenza in gravidanza, sulla stagione di nascita e sulla sensibilità del bambino alla temperatura e agli estremi della luce.

Conformità ai farmaci/aderenza al protocollo di studio

I caregiver riceveranno e-mail settimanali contenenti un link al diario online di conformità e problemi gastrointestinali e un suggerimento/fatto sull’autismo e sulle questioni nutrizionali. I caregiver saranno contattati telefonicamente a 1, 3, 6 e 9 mesi per scopi morali e per incoraggiare la conformità. Gli operatori sanitari riceveranno anche newsletter di prova trimestrali. Le newsletter includeranno un aggiornamento sullo studio, argomenti generici sull’ASD, l’esperienza di un caregiver in relazione a tale argomento e intrattenimenti/concorsi per i bambini dello studio.

Nuovi materiali di intervento saranno inviati ai partecipanti ogni 4 mesi e gli operatori sanitari saranno invitati a mettere da parte i flaconi dei mesi precedenti, con eventuali capsule inutilizzate, per essere restituiti alla loro visita successiva (6 o 12 mesi) in cui le capsule inutilizzate saranno contate e registrate. La conformità al trattamento sarà analizzata contando gli integratori rimanenti di ciascun partecipante una volta completato l’intervento.

Eventi avversi

Tutti i partecipanti saranno richiamati a 6 mesi per un esame del sangue per verificare la presenza di ipervitaminosi D (siero 25(OH)D >225 nmol/L) e ipercalcemia (siero Ca > 2,7 mmol/L). I risultati saranno controllati da una terza parte che non è cieca (ma non ha alcun coinvolgimento nell’analisi dei risultati). Se il livello sierico di 25(OH)D o di calcio del bambino è superiore al limite massimo di sicurezza, la terza parte dis-identificherà i risultati degli esami del sangue e li invierà al pediatra dello studio e allo sperimentatore senior per la revisione e la raccomandazione. Se le concentrazioni di 25(OH)D sono pari o prossime a 225 nmol/L, o se è presente ipercalcemia, la somministrazione della dose sarà aggiustata.

La compliance e i diari dei sintomi gastrointestinali saranno monitorati settimanalmente e tutti gli effetti indesiderati saranno registrati nel registro degli eventi avversi per tenere traccia della salute generale del bambino e delle reazioni comportamentali. In caso di eventi avversi, la salute del bambino sarà monitorata più da vicino per tre o quattro settimane consecutive e, se l’evento avverso persiste, i rapporti saranno indirizzati al pediatra dello studio e allo sperimentatore senior per ulteriori indagini.

Diffusione dei risultati

A seguito della ricezione e dell’analisi del diario alimentare e del completamento dei saggi biochimici allo screening, ogni partecipante riceverà un modulo di feedback. Saranno incluse anche le misurazioni antropometriche e i risultati del sangue (studi sul ferro, vitamina B12, folato e conta ematica completa). Una volta che il reclutamento nel trial è completato, i partecipanti che non hanno proceduto nel trial riceveranno notifica dei loro livelli di acidi grassi vitamina D e RBC.

Al termine dello studio, i partecipanti saranno informati del loro stato basale e finale di vitamina D e acido grasso RBC e se stavano assumendo la dose attiva o placebo. Riceveranno anche una sintesi dei risultati della valutazione psicologica di SRS-2 e SPM.

I partecipanti e le altre parti interessate (come gli operatori sanitari, i consigli sanitari distrettuali, le organizzazioni sanitarie primarie, i gruppi di sostegno ASD) avranno accesso ai risultati dello studio. I risultati saranno presentati a conferenze scientifiche sia a livello nazionale che internazionale, preparati per la pubblicazione su riviste peer-reviewed e diffusi ai media.

Gestione dei dati e analisi statistica

Nome e indirizzo verranno mantenuti in Microsoft Excel. Le caselle di controllo registreranno i progressi di un partecipante durante lo studio. Tutti gli altri dati verranno inseriti in un unico foglio di calcolo Microsoft Excel con i partecipanti identificati solo dal loro numero di oggetto univoco. I punteggi dei questionari saranno ricontrollati dallo psicologo e dal ricercatore. Tutte le voci saranno ricontrollate da un altro membro del team di ricerca. Tutti i documenti saranno conservati in modo sicuro in condizioni riservate e archiviati per 5 anni.

L’analisi statistica verrà eseguita utilizzando IBM SPSS versione 21.0 (IBM Corp; rilasciato 2012. IBM SPSS Statistics per Windows versione 21.0. Armonk, NY, Stati Uniti d’America). Prima dell’inizio dell’analisi statistica i dati saranno puliti e controllati per errori di codifica. I dati saranno controllati per la plausibilità controllando casualmente l’accuratezza e la completezza e verificando i dati di origine. Le variabili saranno testate per la normalità utilizzando il test Kolmogorov-Smirnov, il test Shapiro-Wilk e i grafici di normalità. I dati non distribuiti normalmente saranno trasformati in distribuzioni normali approssimate da trasformazioni logaritmiche. I dati saranno opportunamente segnalati come media (deviazione standard) per i dati normalmente distribuiti; i dati trasformati saranno ritrasformati dalle statistiche di sintesi in media geometrica (IC al 95%), i dati non distribuiti normalmente saranno descritti come mediana (25°, 75 ° percentile) e dati categoriali come frequenze.

Le caratteristiche basali dei partecipanti saranno confrontate tra i gruppi utilizzando l’analisi della varianza (ANOVA) per i dati parametrici e il test Kruskal-Wallis per i dati non parametrici. L’analisi primaria, confrontando gli effetti del trattamento sui sintomi dell’autismo nell’arco di 12 mesi, sarà condotta utilizzando una procedura generalizzata lineare a modelli misti. Trattamenti e tempo saranno inclusi come effetti fissi e le interazioni tra interventi e tempo saranno testati. Se si osservano effetti principali significativi o effetti di interazione, verrà eseguita un’analisi post-hoc con aggiustamenti di Bonferroni. I potenziali fattori confondenti e modificatori dell’effetto(ad esempio acidi grassi basali 25 (OH)D e RBC, sintomi di autismo al basale, età e sesso) saranno studiati all’interno del modello. La regressione logistica verrà utilizzata per testare l’interazione moltiplicativa. L’indice di sinergia di Rothman, che sarebbe uguale all’unità sotto additività e inferiore all’unità quando si suggerisce l’antagonismo, sarà utilizzato per esaminare l’effetto di interazione postulato di vitamina D e omega-3 LCPUFAs sui sintomi principali di ASD.

L’analisi secondaria, che confronta gli effetti del trattamento sui sintomi gastrointestinali nell’arco di 12 mesi, sarà condotta utilizzando la stessa procedura. I potenziali fattori confondenti e modificatori dell’effetto (ad esempio la diagnosi di base di eventuali sintomi gastrointestinali e l’uso di farmaci/integratori) saranno studiati all’interno del modello.

Le differenze tra i partecipanti che completano e si ritirano dallo studio saranno analizzate utilizzando un test t indipendente o il test di Mann–Whitney per le variabili continue (ad esempio età) e il chi-quadrato per le variabili categoriali (ad esempio sesso).

Le associazioni tra la gravità dei sintomi di ASD e lo stato nutrizionale (in particolare, vitamina D, acidi grassi RBC, ferro e vitamina B12) al basale saranno valutate utilizzando l’analisi di regressione. Le informazioni saranno utilizzate per valutare la risposta al trattamento in base ai livelli di stato nutrizionale che mostrano una relazione significativa con la gravità dell’ASD.

Verranno utilizzate sia le analisi intention-to-treat che quelle per protocollo, anche se il metodo principale di analisi sarà intention-to-treat. La significatività statistica sarà basata su test a due code con P <0,05 considerato significativo.