이 게시물은 니콘 이미징 센터의 커트 가시가 기여했습니다.
살아있는 세포 이미징 실험의 일반적인 요구 사항은 형광 태그가 지정된 여러 종을 동시에 따르는 능력입니다. 형광 단백질 라벨과 함께 그렇게 하려면 여러 형광 단백질 그의 여기 및 방출 스펙트럼 현미경에 뚜렷한 형광 채널에 이미징 될 그들을 위해 충분히 다른 필요 합니다. 최근 몇 년 동안 형광 단백질의 확산과 함께,함께 이미지화 될 수있는 많은 형광 단백질 조합이 있지만,이것은 또한 형광 단백질의 선택에 약간의 생각이 필요하다는 것을 의미합니다.
멀티 컬러 이미징 실험을 위해 형광 단백질을 선택하는 첫 번째 단계는 어떤 형광 단백질을 사용할 수 있는지 인식하는 것입니다. 매월 새로운 형광 단백질이 발표되면서 주어진 응용 분야에 가장 적합한 단백질을 결정하는 것은 어려운 일입니다. 최신 형광 단백질 나란히 당신을 유지하기 위해,나는 현재 사용할 수있는 최고의 형광 단백질의 대화 형 그래프와 테이블을 유지한다.
호환 가능한 형광 단백질 선택
함께 이미지화 할 형광 단백질 세트를 선택하려면 개별 형광 단백질을 선택할 때와 동일한 요소를 고려해야합니다(밝기,광 안정성 등;이러한 요소에 대한 자세한 설명은 이전 블로그 게시물 참조). 또한,당신은 또한 서로 구별 할 수 있으며,그 당신이 사용하고자하는 현미경(들)에 광학 이미지로 할 수있는 형광 단백질을 선택해야합니다. 두 개의 형광 단백질이 서로 분리 될 수 있는지 여부를 정확하게 결정하려면 여기 및 방출 스펙트럼에 대한 지식이 필요하지만 엄지 손가락의 좋은 규칙은 두 단백질의 피크 여기 파장과 피크 방출 파장을 모두 50-60 나노 미터로 분리해야한다는 것입니다. 이 경우,두 개의 형광 단백질 사이에 약간의 누화가 있음을 알 수 있습니다. 당신은 누구의 스펙트럼 중복 형광 단백질을 이미지해야하는 경우,형광 단백질을 분리하는 데 사용할 수있는 스펙트럼 언 믹싱 같은 기술이 있지만,이는이 게시물의 범위를 벗어납니다.
당신의 형광 단백질은 당신의 현미경 광학과 호환이 됩니까?
관심있는 형광 단백질이 현미경 광학과 호환되는지 확인하려면 단백질의 여기 및 방출 스펙트럼을 현미경의 필터 세트 또는 레이저와 비교하고 싶을 것입니다. 이상적으로,당신은 단백질이 당신의 현미경에 의해 잘 흥분되고 단백질의 형광 방출이 현미경에 의해 효율적으로 수집되도록 여기 및 방출 필터와 단백질의 여기 및 방출 스펙트럼 사이에 상당한 중첩을 갖고 싶습니다. 형광 단백질과 필터 세트 간의 일치를 비교하기 위해 많은 필터 세트 공급 업체는 단백질과 염료의 형광 스펙트럼과 그 필터를 플로팅하는 도구를 제공합니다(크로마,셈록 또는 오메가 참조). 이러한 일반적인 사용(특히 하지 가장 최근에 출판 된 것 들)에서 모든 형광 단백질을 포함 하지 않는 동안,그들은 좋은 출발점이 될 수 있습니다. 많은 경우에 그것은 밀접 하 게 관련 된 단백질에 대 한 스펙트럼을 사용 하 여 충분 한 관심의 단백질 비슷한 스펙트럼을 알고 있는 경우. 예를 들어,여기에 표준 사이 3 또는 로다 민 필터 세트(크로마#49004)를 비교 크로마 스펙트럼 뷰어에서 스크린 샷입니다.
TagRFP 및 mCherry 여기와 배출량 스펙트럼 등이 있습니다. 여기 스펙트럼은 파란색이고 방출 스펙트럼은 빨간색입니다. 둘 다 필터 세트와 완벽하게 일치하지는 않지만 여기 필터는 여기 피크의 피크를 더 많이 여기시키고 방출 필터는 맥 체리 방출보다 더 많은 부분을 수집합니다. 이 필터 세트의 경우,우리는 맥 체리보다 더 밝은 신호를 줄 것으로 기대합니다. 일반적으로 로다민/씨 3 을 위해 설계된 필터 세트는 맥체리와 같은 더 긴 파장 단백질보다 더 짧은 파장의 적색 형광 단백질로 더 잘 작동합니다. 형광 및 필터 세트에 대한 배경은 형광 현미경 강의 소개를 참조하십시오.일반적으로 사용되는 필터 세트&관련 형광 단백질
405 / 488 / 561 / 640 ). 우리의 손에는 이 세트를 가진 화상 진찰을 위한 제일 형광성 단백질이 있습니다. 이러한 적외선 형광 단백질은 보조 인자로 빌리 베르 딘을 필요로하므로 최대 밝기를 위해 빌리 베르 딘으로 세포를 보충해야 할 수도 있습니다. 포유류 세포에서는 메메랄드 또는 클로버와 같은 향상된 접힘 변종 중 하나가 가장 좋을 것입니다. 에. 세레비시아에,우리는 이 필터 세트로 많은 녹색 및 적색 형광 단백질을 테스트했으며 밝기 측정을보고했습니다. 이 경우,성장 온도가 낮기 때문에 개선된 폴딩 변종을 능가합니다. 그러나 이것은 또한 모든 유기체에 가장 적합한 단일 형광 단백질이 없으며 가장 밝은 신호를 원한다면 관심있는 시스템에서 여러 단백질을 시도해야 할 수도 있음을 시사합니다. 마지막으로,이 단백질 세트에서 녹색 및 빨간색 단백질은 일반적으로 가장 감지 가능하므로 더 풍부한 단백질 또는 마킹 구획에 사용되는 파란색 및 적외선 채널로 가장 풍부한 단백질을 태그하는 데 사용해야합니다.
나는 이것이 형광 단백질로 여러 가지 빛깔의 이미징에 약간의 빛을 비춰주기를 바랍니다. 오른쪽 현미경과 형광 단백질의 올바른 선택으로,동시에 네 가지 색상을 이미징하는 것은 매우 간단해야한다.
게스트 블로거에게 감사드립니다!
커트 쏜은 니콘영상센터의 부교수로 니콘영상센터를 지휘하고 있다. 그는 로널드 베일의 연구소에서 생물 물리학 박사 학위를 받았으며,그 후 하버드 대학의 유전체학 연구 바우어 센터의 연구원이었습니다. 그의 실험실 웹 페이지 또는 그의 현미경 블로그에서 자세히 알아보십시오.
