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이 기사는 단백질 정화의 4 개의 방법에 빛을 던진다.
단백질 정제의 네 가지 방법은(1)추출(2)침전 및 미분 가용화(3)초 원심 분리 및(4)크로마토 그래피 방법이다.
단백질 정제에 사용되는 방법은 대략적으로 분석 방법과 예비 방법으로 나눌 수 있습니다.
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구별은 정확하지 않지만 결정 요인은 단백질의 양이며,그 방법으로 실질적으로 정제 할 수 있습니다. 분석 방법 탐지 하 고 예비 방법 구조 생물학 또는 산업 사용 등 다른 목적을 위해 단백질의 대량 생산을 목표로 하는 반면 혼합물에 단백질을 식별 하는 것을 목표로 합니다. 일반적으로 준비 방법은 분석 응용 프로그램에서 사용할 수 있지만 다른 방법은 사용할 수 없습니다.
방법#1. 추출:
근원에 따라서,단백질은 그것을 포함하는 조직 또는 세포를 끊어서 해결책으로 주어져야 합니다. 이를 달성하기위한 몇 가지 방법이 있습니다;반복적 인 동결 및 해동,초음파 처리,고압에 의한 균질화 또는 유기 용제에 의한 침투. 선택 방법은 단백질이 얼마나 깨지기 쉽고 세포가 얼마나 튼튼한 지에 달려 있습니다.
이 적출 과정 후에 녹는 단백질은 용매에 있고,세포막,디엔에이,등등에서 분리될 수 있습니다. 원심 분리에 의해. 추출 과정은 또한 프로테아제를 추출하여 용액의 단백질을 소화하기 시작합니다. 단백질이 단백질 분해에 과민한 경우에,보통 단백질 분해를 감속하기 위하여 빨리 진행하고,추출물을 냉각된 유지하는 것이 바람직합니다.
방법#2. 대량 단백질 정화에서 단백질을 분리하는 일반적인 첫 번째 단계는 황산 암모늄으로 침전 한 것입니다. 이 황산 암모늄의 증가 금액을 추가 하 고 침전 단백질의 다른 분획을 수집 하 여 수행 됩니다. 이 방법의 한 가지 장점은 매우 큰 볼륨으로 저렴하게 수행 할 수 있다는 것입니다.
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정제 할 첫 번째 단백질은 물 용해 단백질입니다. 완전한 막 단백질의 정화는 동일한 막 격실에 있는 다른 사람에서 어떤 1 개의 특정한 단백질을 고립시키기 위하여 세포막의 붕괴를 요구합니다. 때로는 미토콘드리아 막에 위치한 단백질을 정화하기 전에 세포에서 미토콘드리아를 분리하는 것과 같이 특정 막 견인을 먼저 분리 할 수 있습니다.
나트륨 도데실 설페이트와 같은 세제는 세포막을 용해시키고 정제 중에 막 단백질을 용액에 보관하는데 사용될 수 있다.
방법#3. 초 원심 분리:
원심 분리는 원심력을 사용하여 액체에 부유 된 다양한 질량 또는 밀도의 입자 혼합물을 분리하는 과정입니다. 박테리아 세포와 같은 단백질 또는 기타 미립자 물질의 혼합물을 포함하는 용기(일반적으로 튜브 또는 병)가 고속으로 회전 할 때 각 운동량은 질량에 비례하는 각 입자에 바깥쪽으로 힘을 생성합니다.
이 힘 때문에 주어진 입자가 액체를 통해 이동하는 경향은 액체가 입자에 가하는 저항에 의해 상쇄됩니다. 원심 분리기에서 샘플을”회전”하는 순 효과는 거대하고 작고 밀도가 높은 입자가 덜 거대한 입자 또는 액체에 더 많은”드래그”가있는 입자보다 빠르게 바깥쪽으로 이동한다는 것입니다.
입자의 현탁액이 원심분리기에서”회전”될 때,액체의 항력이 낮은 가장 거대한 입자에 대해 농축되는 용기 바닥에”펠릿”이 형성될 수 있다. 액체에 대부분 남아 있는 나머지,압축되지 않은 입자는”상등액”이라고 불리며,상등액을 펠렛으로부터 분리하기 위해 용기로부터 제거될 수 있다.샘플이 충분히 오랫동안 원심분리되면,용기 내의 입자들은 평형에 도달하게 되며,이때 입자는 부력 밀도가 원심력과 균형을 이루는 용기 내의 지점에 구체적으로 축적된다. 이러한”평형”원심 분리는 주어진 입자의 광범위한 정화를 허용 할 수 있습니다.
자당 구배 원심 분리:
당(일반적으로 수크로오스 글리세롤 또는 퍼콜)의 선형 농도 구배가 튜브에서 생성되어 가장 높은 농도가 바닥에 있고 가장 낮은 농도가 상단에 있습니다. 그런 다음 단백질 샘플을 그라디언트 위에 겹쳐서 초 원심 분리기에서 고속으로 회전시킵니다. 이것은 무거운 고분자가 관의 바닥으로 더 가벼운 물자 보다는 빨리 이동하는 원인이 됩니다.
자당이 없는 상태에서 원심분리하는 동안,입자가 회전 중심으로부터 점점 더 멀리 이동함에 따라,원심력이 점점 더 많이 발생한다(더 멀리 이동할수록 더 빨리 이동한다). 이 문제는 용기 내의 유용한 분리 범위가 작은 관찰 가능한 창으로 제한된다는 것입니다.
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샘플을 두 배나 길게 회전시키는 것이 관심 입자가 두 배나 멀리 갈 것이라는 것을 의미하지는 않습니다. 그러나 단백질이 자당 기온변화도를 통해서 움직일 때,증가 조밀도 및 점성의 액체를 만납니다.
적절하게 설계된 자당 구배는 증가하는 원심력을 상쇄 할 것이므로 입자는 원심 분야에 있었던 시간에 가까운 비율로 움직입니다. 이러한 구배에 의해 분리 된 샘플을”비율 구역”원심 분리라고합니다. 단백질/입자를 분리 한 후,구배는 분별 및 수집된다.
방법#4. 크로마토 그래피 방법:
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일반적으로 단백질 정제 프로토콜은 하나 이상의 크로마토그래피 단계를 포함한다. 크로마토 그래피의 기본 절차는 다양한 재료로 포장 된 열을 통해 단백질을 함유 한 용액을 흐르게하는 것입니다. 다른 단백질은 칼럼 재료와 다르게 상호 작용하며,따라서 칼럼을 통과하는 데 필요한 시간 또는 칼럼에서 단백질을 용리하는 데 필요한 조건에 의해 분리 될 수 있습니다. 보통 단백질은 280 나노미터에 그들의 흡광도에 의해 란 떨어져 오고 있는 때 검출됩니다.
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많은 다른 크로마토그래피 방법이 존재합니다:
1. 크기 제외 크로마토그래피:
크로마토그래피는 다공성 겔을 사용하여 용액 또는 변성 조건에서 단백질을 분리하는 데 사용할 수 있습니다. 이 기술을 크기 제외 크로마토 그래피라고합니다. 원리는 작은 분자가 다공성 매트릭스에서 더 큰 부피를 통과해야한다는 것입니다. 결과적으로,크기의 특정 범위의 단백질은 겔 컬럼의 다른 쪽 끝에서 수집되기 전에 용매(용매)의 가변 부피를 필요로 할 것이다.
단백질 정제의 맥락에서,용기는 일반적으로 다른 시험관에 풀링된다. 순화할 단백질의 잴 수 있는 자취를 포함하지 않는 모든 시험관은 버려집니다. 따라서 나머지 용액은 단백질 정제 및 다른 유사 크기의 단백질로 만들어집니다.
2. 이온 교환 크로마토 그래피:
이온 교환 크로마토 그래피는 이온 전하의 성질과 정도에 따라 화합물을 분리합니다. 사용할 열은 해당 유형 및 충전 강도에 따라 선택됩니다. 음이온 교환 수지는 양전하를 가지며 음으로 하전 된 컴 파운드를 유지하고 분리하는 데 사용되는 반면 양이온 교환 수지는 음전하를 가지며 양으로 하전 된 분자를 분리하는 데 사용됩니다.
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별거가 시작되기 전에 완충기는 반대 위탁된 이온을 평형시키기 위하여 란을 통해서 양수됩니다. 샘플을 주입하면 용질 분자는 각각 수지의 결합 부위에 대해 경쟁하기 때문에 완충 이온과 교환됩니다. 각 용질을 위한 보유의 길이는 그것의 책임의 힘에 달려 있습니다.
가장 약하게 충전 된 화합물이 먼저 용출되고,연속적으로 더 강한 전하를 가진 화합물이 뒤 따른다. 분리 메커니즘의 특성 때문에 산도,버퍼 유형,버퍼 농도 및 온도 모든 분리를 제어에 중요 한 역할을 한다. 이온 교환 크로마토 그래피는 단백질 정화에 사용하기위한 매우 강력한 도구이며 분석 및 예비 분리에 자주 사용됩니다.
3. 선호도 크로마토그래피:
친 화성 크로마토그래피는 분자 구조에 기초한 분리 기술로서,응용 특정 수지를 자주 사용한다. 이 수지에는 분리될 화합물을 위해 특정한 그들의 표면에 붙어 있는 리간드가 있습니다. 가장 빈번하게,이 리간드는 항체 항원 상호 작용의 그것과 유사한 유행에서 작용합니다. 이”잠금 및 키”는 리간드와 그 표적 화합물 사이에 적합하여 매우 특이적이며 종종 단일 피크를 생성하는 반면 샘플의 다른 모든 것은 유지되지 않습니다.
많은 막 단백질은 당 단백질이며 렉틴 친 화성 크로마토 그래피에 의해 정제 될 수있다. 세제 가용화 된 단백질은 공유 결합 된 렉틴을 갖도록 변형 된 크로마토 그래피 수지에 결합 할 수 있습니다.
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렉틴에 결합하지 않는 단백질은 씻겨 나가고,특히 결합 된 당 단백질은 렉틴 결합 부위에서 결합 된 당 단백질과 경쟁하는 고농도의 설탕을 첨가하여 용출 될 수 있습니다. 몇몇 렉틴에는 설탕과 경쟁하기 단단한 당단백질의 올리고당에 결합하는 높은 친화력이 있고,바운드 당단백질은 렉틴을 변성시켜서 풀어 놓일 필요가 있습니다.
4. 금속 결합:
일반적인 기술은 단백질의 씨-말단에 6~8 히스티딘의 서열을 엔지니어링하는 것을 포함한다. 폴리히스티딘은 니켈 및 코발트와 같은 2 가 금속 이온에 강하게 결합합니다. 단백질은 폴리히스티딘 태그를 결합하는 고정화 된 니켈 이온을 포함하는 칼럼을 통과 할 수 있습니다. 태그가 지정되지 않은 모든 단백질은 열을 통과합니다.
단백질은 이미다졸로 용출될 수 있는데,이는 컬럼에 결합하기 위해 폴리히스티딘 태그와 경쟁하거나,수지에 대한 태그의 친화성을 감소시키는 산도(통상적으로 4.5 로)의 감소에 의해 용출될 수 있다. 이 절차는 일반적으로 설계된 친 화성 태그(예:6 가 태그 또는 클론 테크의 모자 태그)가있는 재조합 단백질의 정제에 사용되지만 고유 한 친 화성 토르 2 가 양이온을 가진 천연 단백질에도 사용할 수 있습니다.
5. 크로마토그래피:
면역아피도 크로마토그래피는 표적 단백질에 대한 항체의 특이 적 결합을 사용하여 단백질을 선택적으로 정제한다. 이 절차는 항체를 칼럼 물질에 고정시킨 다음 선택적으로 단백질을 결합하는 반면 다른 모든 것은 흐릅니다. 이 단백질은 산도 또는 염분을 변화시킴으로써 용출 될 수 있습니다. 이 방법은 꼬리표안에 기술설계를 관련시키지 않기 때문에,자연적인 근원에서 단백질을 위해 사용될 수 있는다.
6. 2014 년:
고성능 액체 크로마토그래피 또는 고압 액체 크로마토그래피는 컬럼을 통해 용질을 더 빠르게 구동하기 위해 고압을 가하는 크로마토그래피의 한 형태이다. 이 확산이 제한되고 해상도가 향상되는 것을 의미한다. 가장 일반적인 형태는 열 재료가 소수성 인”역상”입니다.
단백질은 아세토니트릴과 같은 유기 용매의 양이 증가하는 구배에 의해 용출된다. 단백질은 소수성에 따라 용출됩니다. 정제 후 단백질은 휘발성 화합물만을 함유 한 용액에 있으며 쉽게 동결 건조 될 수 있습니다. 또한 정제된 단백질의 변성을 초래하므로 자발적으로 재포장되지 않는 단백질에는 적용되지 않습니다.
