튜넬 분석실험은 프로그램된 세포사멸의 한 형태인 세포사멸을 겪고 있는 세포를 검출하는데 가장 일반적으로 사용된다. 아폽토시스는 발달 도중,그리고 유지 조직 항상성을 위한 중요한 생물학 과정입니다. 튜넬 염색은 세포 사멸 세포의 시각화 및 정량화를 허용합니다. 이것은 과학자들이 세포 사멸이 암과 같이 억제되거나 신경 퇴행에서와 같이 강화되는 장애에 대한 새로운 치료법의 효능을 테스트하는 데 도움이됩니다.
이 비디오는 튜넬 분석법을 사용하여 조직 섹션에서이 방법을 수행하기위한 단계별 프로토콜 인 세포 사멸을 겪고있는 세포에 라벨을 붙일 수있는 방법과 연구자가 세포 사멸의 메커니즘을 이해하기 위해이 기술을 적용하는 방법을 설명합니다.
튜넬 분석의 프로토콜을 탐구하기 전에,이 기술의 뒤에 원리를 토론하자.
세포 사멸의 많은 특징 중 하나는 유전자 단편화입니다. 유전자 분열은 어떻게 발생합니까? 세포 사멸은 세포질에 존재하는 카스파 제라고 불리는 효소에 의해 수행됩니다. 그들의 주요 역할은 세포를 분해하기 위해 단백질을 절단하는 것입니다. 또한 카스파 제는 카스파 제 활성화 드나 제 또는 캐드라는 효소를 억제제 인 이카 드에서 분리하여 활성화시킵니다. 활성화된 치사한 사람은 핵에 이동하고 염색체 유전자를 절단하는 엔도 뉴클레아제입니다. 그리고,튜넬 분석에서는 이러한 조각난 유전자 끝부분을 형광으로 표시하여,과학자들이 세포 사멸을 검출할 수 있게 한다. 그러나 어떻게 이런 일이 발생합니까? 이를 위해 당신은 튜넬 반응을 이해해야합니다. 튜넬은 말단 데 옥시 뉴클레오티딜 전이 효소-매개 더프 닉-엔드 라벨링을 의미합니다. 두 가지 주요 튜넬 시약은 말단 데옥시뉴클레오티딜 전이 효소,또는 티디티,및 데옥시우리딘 트리포스페이트,또는 더프이며,이는 검출의 용이성을 위해 형광 표지될 수 있다.
튜넬 반응을 이해하기 위해 유전자 조각을 가진 세포 사멸 세포로 돌아가 보자. 이 새긴 조각에는 자유로운 3’수산기 그룹이 있습니다. 일단 당신이 세포 사멸 세포를 포함하는 샘플에 튜넬 시약을 추가하면,형광 표지 된 더프는 촉매 효소의 도움으로 이들 3’히드 록실 그룹에 부착됩니다. 이 절차를 사용하여 염색 된 세포를 튜넬 양성 세포라고하며,형광 현미경을 사용하여 시각화 할 수 있습니다.
이제 튜넬 분석의 기본 원리와 개념을 이해 했으므로 조직 섹션에서이 기술을 수행하기위한 일반적인 프로토콜을 간략하게 설명하겠습니다. 튜넬 분석의 주요 단계는 관심있는 조직 고정,조직의 침투,튜넬 시약 추가,튜넬 반응 중지 및 마지막으로 분석을 포함합니다.
첫째,관심 조직은 생물학적 구조를 보존하기 위해 고정되어야합니다. 고정은 세포 내에서 단백질을 가교 결합시켜 작동합니다. 튜넬 분석실험을 위해,조직은 4%파라포름알데히드를 함유하는 용액에 4-24 시간 동안 4%파라포름알데히드를 첨가함으로써 고정될 수 있다.
다음 단계는 투과 화이며,이는 세포핵을 관통하는 효소 등의 시약을 허용한다. 조직 섹션의 침투는 상온에서 15-30 분 동안 궤도 셰이커에 인산염 완충 식염수로 조직 섹션을 헹굽니다.
투과 후,튜넬 반응을 위한 보조 인자로 작용하는 코발트를 포함하는 라벨링 완충액과 함께,티디디티 효소 및 형광 표지된 더프를 조직 섹션에 첨가한다. 함께,튜넬 반응 혼합물 및 조직 섹션은 37 에서 1-3 시간 동안 배양되고,빛으로부터 보호되어 형광이 퇴색하는 것을 방지한다.
인큐베이션 후,정지 완충액을 조직 섹션에 첨가하여 튜넬 반응을 중단하고,짧은 배양 후 섹션을 인산염 완충 식염수로 세척한다. 마지막으로,형광 태그 더프를 사용 하 여 스테인드 조직 섹션 형광 현미경을 사용 하 여 시각화 하 고 주어진된 조직 내에서 튜넬 양성 세포의 현지화에 대 한 평가. 하나는 단순히 주어진 조직 섹션에서 튜넬 양성 세포의 비율을 계산하여 세포 사멸을 정량화 할 수 있습니다.
이제 세포 사멸 세포를 검출하기 위해 튜넬 분석을 수행하는 방법을 보았으므로,이 분석이 세포 생물 학자들이 묻는 질문을 해결하는 데 어떻게 사용될 수 있는지 논의 해 봅시다.
세포 사멸은 조직과 구조의 조각 및 불필요한 세포의 제거를위한 발달의 정상적인 부분으로 발생합니다. 따라서이 현상에 관심이있는 과학자들은 발달 중 세포 사멸에 대한 다른 물질에 대한 태아 노출의 영향을 연구합니다. 여기서 과학자들은 태아 알코올 노출이 뇌 발달에 미치는 영향을 조사하는 데 관심이있었습니다. 태아 두뇌에 수행 하는 튜 넬 염색의 결과 공개 제어 동물에 비해 알코올에 산 전 노출 된 조직에서 증가 아폽토시스.
과학자들은 또한 세균 감염에 대한 반응으로 세포 사멸을 조사하기 위해 튜넬 분석을 사용합니다. 이 실험에서 과학자들은 쥐에게 폐 염증을 유발하는 녹농균을 주사하여 폐렴 모델을 개발했습니다. 그 후,폐 조직을 제거하고 튜넬 염색을 수행하여 세균 감염에 반응하여 세포 사멸을 검사 하였다. 결과 세포 사멸 제어 동물에 비해 박테리아에 노출 된 마우스에서 증가 보여줍니다.
마지막으로,튜넬 염색은 약물에 대한 종양 반응성을 결정하기 위해 인간 종양 샘플에 사용될 수 있다. 이 예에서,종양 샘플을 인간 환자로부터 수확하고 생체 외 배양 하였다. 다음으로,그들은 전임상 약으로 대우되고 튜넬 분석실험을 사용하여 응답을 위해 사정되었습니다. 얻은 데이터는 열 충격 단백질 90 을 억제하는 약물로 치료하면 종양 조직의 세포 사멸이 크게 증가한다는 것을 보여줍니다.
당신은 세포 사멸을 겪고있는 세포를 검출하기 위해 튜넬 분석법을 사용하는 조브의 비디오를 보았습니다. 이 비디오 튜넬 염색,뒤에 원리 및 조직 섹션에 튜넬 분석 결과 수행 하는 단계별 프로토콜 검토. 우리는 또한이 방법을 개발 및 질병 중에 프로그램 된 세포 사멸을 이해하는 데 어떻게 적용 할 수 있는지 검토했습니다. 언제나처럼,시청 해 주셔서 감사합니다!
