단백질 정화편집
폴리히스티딘-태그는 대장균 및 기타 원핵 발현 시스템에서 발현되는 폴리히스티딘-태그 재조합 단백질의 친 화성 정제에 종종 사용된다. 세균성 세포는 원심 분리를 통해 가을걷이되고 육체적인 방법 또는 이들의 라이소자임 또는 어떤 조합든지와 같은 세제 그리고 효소에 의하여 용해되는 유래 세포 펠릿. 이 단계에서 원시 용 해물은 박테리아 숙주에서 유래 한 다른 많은 단백질 중에서 재조합 단백질을 포함합니다. 이 혼합물은 다른 품종으로 상업적으로 이용 가능한 결합 된 2 가 니켈 또는 코발트 이온을 함유하는 친 화성 수지로 배양된다. 니켈과 코발트는 유사한 특성을 가지고 있으며 인접한 기간 4 전이 금속(철 트라이어드)입니다. 이러한 수지는 일반적으로 폴리히스티딘-태그가 마이크로몰 친화도와 결합하는 코발트에 대한 니켈 및 카르복실기-메틸 아스파르테이트(공-씨마)에 대한 이미노디아 아세트산(니-아이다)및 니트릴로트리아세트산과 같은 킬레이트로 기능화되는 세파로스/아가로오스이다. 에른스트 호출리 외. 1987 년 리간드와 니켈 이온을 아가 로스 비드에 결합시켰다. 수지는 인산염 완충기로 그 때 특히 코발트 또는 니켈 이온과 상호 작용하지 않는 단백질을 제거하기 위하여 세척됩니다. 니켈 기반 방법을 사용하면 20 밀리미터 이미 다졸(단백질은 일반적으로 150-300 밀리미터 이미 다졸로 용출 됨)을 첨가하여 세척 효율을 향상시킬 수 있습니다. 일반적으로 니켈 기반 수지는 더 높은 결합 용량을 가지며 코발트 기반 수지는 가장 높은 순도를 제공합니다. 단백질의 순도와 양은 서방 및 서방 블로 팅에 의해 평가 될 수 있습니다.
폴리히스티딘 태그를 이용한 친 화성 정제는 일반적으로 재조합 단백질이 원핵 생물에서 발현될 때 비교적 순수한 단백질을 초래한다. 단백질 상호 작용을 연구 하기 위해 단백질 복합체의 정화를 포함 하 여 다운스트림 응용 프로그램에 따라 효 모 또는 다른 진 핵 생물 등 높은 유기 체에서 정제 높은 순도를 산출 하기 위해 두 개의 태그를 사용 하 여 탠덤 선호도 정화를 요구할 수 있습니다. 대안 적으로,니켈 이온보다는 고정화 된 코발트 이온을 사용하는 단일 단계 정제는 일반적으로 순도의 상당한 증가를 산출하고 그의 태그가 지정된 단백질의 용출을 위해 더 낮은 이미 다졸 농도를 필요로한다.
폴리히스티딘 태깅은 그 작용 방식이 단백질의 1 차 구조에만 의존하기 때문에 변성 조건에서 재조합 단백질을 정제하기 위한 선택 옵션이다. 예를 들어,재조합 단백질이 강제로 표현 된 경우에도 전자. 대장균은 봉입체를 생성하며 가용성 단백질로 얻을 수 없으며 요소 또는 구아니딘 염산염으로 변성으로 정제 할 수 있습니다. 일반적으로 이러한 종류의 기술에 대해 히스티딘 결합은 이미 다졸 결합 대신 산도를 사용하여 적정됩니다-높은 산도에서는 히스티딘이 니켈 또는 코발트에 결합하지만 낮은 산도(코발트의 경우~6,니켈의 경우~4)에서는 히스티딘이 양성자가되어 금속 이온과 경쟁합니다. 이를 항체 정제 및 질식사 정제와 비교하십시오.이 정제는 관련된 단백질의 적절한(기본)접힘 인 전제 조건입니다. 다른 한편으로,그의 태그는 다른 친 화성 태그보다 더 많이 집계 및 불용성화되는 경향이 있다고합니다.
폴리히스티딘-태그 컬럼은 몇몇 잘 알려진 단백질을 불순물로서 보유한다. 그 중 하나는 펩 티딜 프로 릴 이소 머라 제,약 25 킬로다(슬리 드)에 나타난다. 불순물은 일반적으로 2 차 크로마토 그래피 기술을 사용하거나 재조합 단백질을 슬리 드 결핍 대장균 균주로 표현함으로써 제거됩니다. 양자택일로,니켈 근거한,코발트 근거한 수지와 비교해서 대장균에서 미끄러짐을 가진 더 적은 친화력이 있습니다,그러나 몇몇 경우에,적당히 도움이 됩니다.
2 개의 폴리히스티딘 태그로부터 1 개를 분리편집
상이한 수의 폴리히스티딘 태그를 갖는 단백질은 니켈-친화성 수지로부터 다르게 용리된다. 단일 헥사히스티딘 태그를 갖는 단백질의 경우,75 밀리 이미다졸은 니켈-엔타로부터의 용출을 가능하게 하는 반면,2 개의 헥사히스티딘 태그를 갖는 단백질의 경우,용출을 위해 100 밀리 이미다졸이 요구된다. 이러한 단계적 용출은 정의된 헤테로멀티머와 같은 혼합물로부터 특정 단백질 어셈블리를 분리하는데 사용될 수 있다. 이러한 접근법은 1 가 스트렙타 비딘의 격리에 사용되었다.
결합 분석편집
폴리히스티딘 태깅은 풀다운 분석과 동일한 방식으로 단백질-단백질 상호 작용을 검출하는데 사용될 수 있다. 그러나,이 기술은 일반적으로 덜 민감한 것으로 간주되며,또한이 기술의 더 까다로운 측면 중 일부에 의해 제한됩니다. 예를 들어,환원 조건은 사용할 수 없으며,에드 타 및 많은 종류의 세제를 사용할 수 없습니다. 이중 편광 간섭계의 최근 진보는 시약의 광범위한 사용에 적용 가능하며 이러한 사이트 별 태그를 사용하면 관련 구조적 변화의 직접적인 측정이 크게 단순화됩니다.
형광 태그편집
헥사히스타딘 사이디 태그도 개발되었다. 이들은 폴리히스티딘 꼬리표에 붙이는 염료를 창조하기 위하여 형광소에 붙어 있던 에타 그룹에 니켈 공유 결합 조정을 이용합니다. 이 기술은 다음과 같은 단백질 이동 및 인신 매매에 효과적인 것으로 나타났습니다. 또한 형광 공명 에너지 전달을 통해 거리를 측정 하기 위해 효과적일 수 있습니다이 기술을 보여 주는 최근 발견 되었습니다.
플루오로 히스티딘 태그편집
시험관 내 번역 시스템에서 사용하기 위해 폴리 플루오로 히스티딘 태그가 보고되었다. 이 시스템에서는 히스티딘이 4-플루오로 히스티딘으로 대체되는 확장 된 유전자 코드가 사용됩니다. 플루오르화 아날로그는 히스티딘-트르나 리가 제의 이완 된 기질 특이성을 통해 펩티드에 통합되고 태그의 전체 피카을 낮춘다. 이 세척 버퍼의 산도를 변경하여 기존의 폴리 히스티딘 태그의 복잡한 혼합물의 존재 폴리 플루오로 히스티딘 태그 펩티드의 선택적 농축을 할 수 있습니다.
