형광 염료를 사용한 다색 염색은 조직 및 세포 연구 분야에서 생물학적 물질(예:단백질,지질,핵산 및 이온)의 분포를 관찰하는 데 적극적으로 사용됩니다. 형광 관측을 위한 탐지 기술은 단 하나 형광성 염료 분자가 상황의 베스트의 밑에 검출될 수 있는 수준에 전진했습니다. 이 섹션에서는 새로운 형광 현미경 기술인 형광 수명 이미징 현미경 검사의 중요한 측면 중 몇 가지를 검토합니다. 다색 염색 이외에,형광 수명 이미징은 염료 분자의 형광 수명 특성,즉 분자 주변 환경의 상태에 영향을 미치는 요인을 시각화하기 위해 활용 될 수 있습니다.
파장 분광학
종래의 형광 현미경은 형광 염료의 색 특성을 이용하는데,즉,식별은 염료 간의 형광 스펙트럼 특성의 차이에 기초한다. 이 기술로,자외선에서 가까운 적외선에 파장 범위에 있는 5 개 6 개의 염료는 색깔 사이 혼란 없이 현미경의 밑에 동시에 이용될 수 있습니다.
수명 분광학
각 형광 염료는 여기 상태에서 자체 수명을 갖습니다. 수명의 차이를 검출함으로써,동일한 형광색을 갖는 염료도 구별할 수 있을 뿐만 아니라,자가형광을 식별할 수 있다. 또한 일반적으로 사용되는 형광 염료에 비해 수명이 매우 긴 프로브를 사용하여 높은 신호 대 잡음 이미지를 얻을 수 있습니다. 예를 들면,백금 코프로포르피린은 수명의 밀리초 차수를 갖는 반면,일반적인 형광 염료의 수명은 나노초 차수입니다. 이러한 비교적 수명이 긴 형광 염료는 곧 칩에 대한 유전자 검출을위한 프로브로 사용될 것입니다.
형광 수명 영상은 또한 살아있는 세포를 관찰하면서 분자에 대한 정보를 얻을 수있게한다. 형광 수명에 영향을 미치는 요인에는 이온 강도,소수성 특성,산소 농도,분자 결합 및 두 단백질이 서로 접근 할 때 에너지 전달에 의한 분자 상호 작용이 포함됩니다. 그러나 수명은 염료 농도,광 표백,광 산란 및 여기 광 강도와 무관합니다. 따라서 형광 수명 이미징을 통해 정확한 이온 농도 측정 및 형광 공명 에너지 전달(프렛)분석을 수행 할 수 있습니다.
형광 수명 이미징에는 시간 도메인 방법과 주파수 도메인 방법의 두 가지 방법이 있습니다.
- 시간 영역 플림-펄스 레이저에 의한 여기 후 지연의 경우에,형광 이미지는 이미지 인텐시파이어의 게이트 작동에 의해 얻어질 수 있다. 여기 상태의 수명은 일반적으로 1~20 나노초이기 때문에 수명은 몇 백 피코 초의 펄스 지속 시간과 나노초 수준의 셔터를 가진 레이저에 의해 나노초 단위로 측정됩니다. 고속 게이트 이미지 인 텐시 파이어는 하마 마츠 포토닉스(일본 하마 마츠)에서 시판됩니다. 각 픽셀에서의 형광 수명은 게이트가 열릴 때까지 지연 시간을 변화시키면서 측정함으로써 얻을 수 있습니다. 형광 수명 이미지는 수명에 따라 의사 색으로 표시됩니다.
- 주파수 영역 플림-형광 수명은 여기 광원으로 사용되는 레이저가 변조 될 때 게인 변조기가있는 검출기를 사용하여 형광의 위상 변화와 진폭의 감소를 측정하여 계산됩니다(1~200 메가 헤르츠). 측정은 레이저 스캐닝(포토 멀티플라이어)또는 전하 결합 장치를 사용하여 수행 할 수 있습니다.
응용 분야
프로브를 둘러싼 환경은 형광 수명이 수소 이온 농도(산도),산소 및 칼슘 이온 농도에 민감하다는 사실을 기반으로 감지됩니다. 분자 사이의 결합 또는 상호 작용은 또한 프렛과 함께 측정 할 수 있습니다.
칼슘 이온 농도 이미징
칼슘 이온이 푸라 -2,플루오 -3 또는 칼슘 그린과 같은 형광 프로브에 결합하면 형광 수명과 형광 강도가 모두 변합니다. 이온 농도 측정을 위한 종래의 절차는 강도의 변화에 초점을 맞춥니다. 칼슘 이온 농도의 변화에 따라 결합 된 칼슘 이온과 결합되지 않은 칼슘 이온 사이의 염료 비율이 변경되며,이로 인해 시편의 측정 지점의 형광 수명이 변경됩니다. 칼슘 이온 프로브 이외에,이 기술은 또한 산도 및 나트륨 이온 및 마그네슘 이온과 같은 다른 이온의 측정에 적용 가능합니다.형광 공명 에너지 전달(프렛)
연구는 현재 녹색 형광 단백질 변이체에 의해 프렛(다른 형광 색을 갖는 형광 단백질 변이체)에 대해 수행되고 있다. 프렛은 한 쌍의 형광 염료로 표지 된 두 단백질 사이의 상호 작용(연관 또는 해리)을 측정 할 수있게합니다. 기증자 형광 염료에는 수락자 형광 염료에 에너지를 제공하는 더 짧은 흥분/방출 파장이 있습니다. 기증자 염료의 여기 상태의 수명은 수용체(에너지를 받는 염료)의 존재 여부에 따라 가변적입니다. 이 검출하는 동안 형광의 중첩을 고려할 필요가 없기 때문에 수명에 따라 측정은 더 나은 정량화 할 수 있습니다.
임상 영상
일부 조직 및 세포 진단 표본이 강한자가 형광을 갖기 때문에 수명이 긴 프로브(최대 밀리 초)의 사용이 시도되었습니다. 긴 수명 프로브는 동시에 사용할 수 있는 색상의 수가 이 기술로 제한되기 때문에 형광 현장 하이브리드 화(물고기)에도 유용합니다. 혈액에서 수소 이온 농도,뿐만 아니라 산소와 이산화탄소 압력,이미 형광 수명에 따라 측정 된,이러한 측정은 여전히 현미경 하에서 가능하지 않지만.
인터넷 자원
- 형광 분광학 센터-교수 조셉 알 주최. 메릴랜드 대학의 라코 위츠,이 웹 사이트는 형광 수명 이미징 및 형광 분광학 및 현미경의 다른 측면에 대한 정보를위한 훌륭한 자원이다.
- 켄텍 인스트루먼트-켄텍은 형광 수명 이미징을 위한 고전압 솔리드 스테이트 펄스 발생기 및 광학 게이트 이미징 시스템을 제조하고 있습니다.
- 하마마츠 포토닉스-뛰어난 디지털 카메라 시스템 외에도 포토멀티플라이어,애벌란시 포토다이오드,고속 게이트 이미지 인텐시파이어 등을 제조하고 있습니다.
- PRS 생명과학부-전문으로 생물학적 형광 현미경,PRS 생명과학 제조 수리용 부품시장시-게이트 시스템에 적용할 수 있는 많은 연구를 현미경.
