Métodos de purificação de proteínas: 4 métodos

este artigo lança luz sobre os quatro métodos de purificação de proteínas.

os quatro métodos de purificação de proteínas são: (1) extracção (2) precipitação e solubilização Diferencial (3)Ultracentrifugação e (4) métodos cromatográficos.

os métodos utilizados na purificação de proteínas podem ser divididos em métodos analíticos e preparatórios.Anúncios publicitários:

A distinção não é exata, mas o fator decisivo é a quantidade de proteína, que pode praticamente ser purificada com esse método. Os métodos analíticos destinam-se a detectar e identificar uma proteína numa mistura, ao passo que os métodos de preparação visam produzir grandes quantidades da proteína para outros fins, tais como a biologia estrutural ou a utilização industrial. Em geral, os métodos de preparação podem ser utilizados em aplicações analíticas, mas não o contrário.

Método # 1. Extraccao:

dependendo da fonte, a proteína tem de ser trazida para a solução, quebrando o tecido ou células que a contêm. Existem vários métodos para conseguir isso; congelação e descongelação repetidas, sonificação, homogeneização por alta pressão ou permeabilização por Solventes orgânicos. O método de escolha depende da fragilidade da proteína e da robustez das células.

após este processo de extracção, a proteína solúvel encontra-se no solvente e pode ser separada das membranas celulares, ADN, etc. por centrifugação. O processo de extração também extrai proteases, que vão começar a digerir as proteínas na solução. Se a proteína é sensível à proteólise, é geralmente desejável proceder rapidamente, e manter o extrato arrefecido, para retardar a proteólise.

Método # 2. Precipitação e solubilização diferencial:

na purificação de proteínas a granel, um primeiro passo comum para isolar as proteínas é a precipitação com sulfato de amónio (NH4)2SO4. Para tal, adiciona-se quantidades crescentes de sulfato de amónio e recolhe-se as diferentes fracções de proteína do precipitado. Uma vantagem deste método é que ele pode ser realizado de forma barata com volumes muito grandes.Anúncios publicitários:

as primeiras proteínas a serem purificadas são proteínas solúveis em água. A purificação das proteínas integrais da membrana exige a ruptura da membrana celular, a fim de isolar qualquer uma das proteínas particulares de outras que estão no mesmo compartimento de membrana. Às vezes, uma determinada tração de membrana pode ser isolada em primeiro lugar, como isolar mitocôndrias de células antes de purificar uma proteína localizada em uma membrana mitocondrial.

um detergente como o dodecilsulfato de sódio (SDS) pode ser usado para dissolver membranas celulares e manter as proteínas de membrana em solução durante a purificação; no entanto, devido à SDS causar desnaturação, detergentes mais leves como Triton X-100 ou CHAPS podem ser usados para manter a conformação nativa da proteína durante a purificação.

Método # 3. Ultracentrifugação:

centrifugação é um processo que utiliza a força centrífuga para separar misturas de partículas de massas ou densidades variáveis suspensas num líquido. Quando um recipiente (normalmente um tubo ou frasco) contendo uma mistura de proteínas ou outras partículas, como as células bacterianas, é rodado em altas velocidades, o momento angular produz uma força externa para cada partícula que é proporcional à sua massa.

a tendência de uma dada partícula a mover-se através do líquido devido a esta força é compensada pela resistência que o líquido exerce sobre a partícula. O efeito líquido de ” girar “a amostra em uma centrifugadora é que partículas maciças, pequenas e densas se movem para fora mais rápido do que partículas menos massivas ou partículas com mais” arrastar ” no líquido.

quando suspensões de partículas são “fiadas” numa centrifugadora, um “sedimento” pode formar-se no fundo do recipiente que é enriquecido para as partículas mais maciças com baixo arrasto no líquido. As restantes partículas não compactadas que ainda permanecem principalmente no líquido são chamadas de “sobrenadantes” e podem ser removidas do recipiente para separar o sobrenadante do sedimento.

A taxa de centrifugação é especificado pela aceleração angular aplicada à amostra, normalmente medido em comparação com a g. Se as amostras são centrifugadas por tempo suficiente, as partículas no navio irá alcançar equilíbrio no qual as partículas se acumulam especificamente em um ponto no reservatório, onde sua densidade flutuante é equilibrada com a força centrífuga. Tal centrifugação de “equilíbrio” pode permitir a purificação extensiva de uma dada partícula.Centrifugação com gradiente de sacarose:

um gradiente linear de concentração de açúcar (tipicamente sacarose glicerol, ou Percoll) é gerado em um tubo de tal forma que a maior concentração é no fundo e mais baixa no topo. Uma amostra de proteína é então colocada sobre o gradiente e girada a altas velocidades em um ultracentrifuge. Isso faz com que macromoléculas pesadas migrem para o fundo do tubo mais rápido do que material mais leve.Durante a centrifugação na ausência de sacarose, à medida que as partículas se afastam cada vez mais do centro de rotação, elas experimentam cada vez mais força centrífuga (quanto mais se movem, mais rápido se movem). O problema com isso é que o intervalo de separação útil dentro da embarcação é restrito a uma pequena janela observável.Anúncios publicitários:

girar uma amostra duas vezes mais longo não significa que a partícula de interesse vai duas vezes mais longe; na verdade, ele vai significativamente mais longe. No entanto, quando as proteínas estão se movendo através de um gradiente de sacarose, elas encontram líquido de densidade crescente e viscosidade.

um gradiente de sacarose devidamente concebido irá neutralizar a força centrífuga crescente, de modo que as partículas se movem em proporção próxima ao tempo em que estiveram no campo centrífugo. As amostras separadas por estes gradientes são referidas como centrifugações “rate zonal”. Depois de separar a proteína / partículas, o gradiente é então fraccionado e coletado.

Método # 4. Métodos cromatográficos:

normalmente um protocolo de purificação de proteínas contém uma ou mais etapas cromatográficas. O procedimento básico na cromatografia é o escoamento da solução que contém a proteína através de uma coluna cheia de vários materiais. Diferentes proteínas interagem de forma diferente com o material da coluna, e podem, portanto, ser separadas pelo tempo necessário para passar a coluna, ou as condições necessárias para eluir a proteína da coluna. Normalmente, as proteínas são detectadas quando saem da coluna pela sua absorvância a 280 nm.Anúncios publicitários:

existem muitos métodos cromatográficos diferentes:

1. Cromatografia de exclusão por dimensão:

cromatografia pode ser utilizada para separar proteínas em solução ou em condições de desnaturação utilizando géis porosos. Esta técnica é conhecida como cromatografia de exclusão por tamanho. O princípio é que moléculas menores têm que atravessar um volume maior em uma matriz porosa. Consequentemente, as proteínas de uma determinada gama de dimensões necessitarão de um volume variável de eluente (solvente) antes de serem recolhidas na outra extremidade da coluna de gel.

no contexto da purificação de proteínas, o eluente é normalmente agrupado em diferentes tubos de ensaio. Todos os tubos de ensaio que não contenham vestígios mensuráveis da proteína a purificar são rejeitados. A solução restante é, portanto, feita da proteína para purificar e quaisquer outras proteínas de tamanho semelhante.

2. Cromatografia de troca iónica:

cromatografia de troca iónica separa compostos de acordo com a natureza e o grau da sua carga iónica. A coluna a utilizar é seleccionada de acordo com o seu tipo e resistência de carga. As resinas de troca de anião têm uma carga positiva e são usadas para reter e separar as com pounds carregadas negativamente, enquanto as resinas de troca catiónica têm uma carga negativa e são usadas para separar moléculas carregadas positivamente.Anúncios publicitários:

antes da separação começar, um buffer é bombeado através da coluna para equilibrar os iões carregados opostos. Após a injecção da amostra, as moléculas solúveis trocam-se com os iões-tampão à medida que cada uma concorre pelos locais de ligação da resina. O comprimento de retenção para cada soluto depende da força de sua carga.

os compostos mais fracamente carregados irão fluir primeiro, seguindo-se aqueles com cargas sucessivamente mais fortes. Devido à natureza do mecanismo de separação, pH, tipo de tampão, concentração de tampão, e temperatura, todos desempenham papéis importantes no controle da separação. A cromatografia de troca iônica é uma ferramenta muito poderosa para o uso na purificação de proteínas e é frequentemente utilizada tanto em separações analíticas como preparatórias.

3. Cromatografia De Afinidade: A cromatografia de afinidade é uma técnica de separação baseada na conformação molecular, que frequentemente utiliza resinas específicas de Aplicação. Estas resinas têm ligantes ligados a suas superfícies que são específicas para os compostos a serem separados. Mais frequentemente, estes ligantes funcionam de uma forma semelhante à das interacções anticorpo-antigénio. Esta” chave e fechadura ” encaixam entre o ligante e o seu composto alvo, tornando-o altamente específico, gerando frequentemente um único pico, enquanto tudo o resto na amostra não é retido.Muitas proteínas de membrana são glicoproteínas e podem ser purificadas por cromatografia de afinidade de lectina. As proteínas solubilizadas detergentes podem ligar-se a uma resina cromatográfica que foi modificada para ter uma lectina covalentemente ligada.Anúncios publicitários:

as proteínas que não se ligam à lectina são lavadas e, em seguida, as glicoproteínas especificamente ligadas podem ser eluídas adicionando uma elevada concentração de um açúcar que concorre com as glicoproteínas ligadas no local de ligação da lectina. Algumas lectinas têm elevada afinidade de ligação aos oligossacáridos das glicoproteínas que são difíceis de competir com os açúcares, e as glicoproteínas ligadas precisam de ser libertadas através da desnaturação da lectina.

4. Ligação Metálica:

uma técnica comum envolve a engenharia de uma sequência de 6 a 8 histidinas no terminal C da proteína. A poliistidina liga-se fortemente a iões metálicos divalentes, tais como níquel e cobalto. A proteína pode ser passada através de uma coluna contendo iões de níquel imobilizado, que se liga à etiqueta de poliistidina. Todas as proteínas não marcadas passam pela coluna.

a proteína pode ser elutida com imidazol, o que compete com a etiqueta de poliistidina para a ligação à coluna, ou por uma diminuição do pH (tipicamente para 4, 5), o que diminui a afinidade da etiqueta para a resina. Embora este procedimento seja geralmente usado para a purificação de proteínas recombinantes com uma etiqueta de afinidade engenharia (como uma tag 6xHis-tag ou tag de chapéu de Clontech), ele também pode ser usado para proteínas naturais com uma afinidade inerente cátions divalentes tor.

5. Cromatografia De Imunoafinidade: A cromatografia de Imunoafinidade utiliza a ligação específica de um anticorpo à proteína-alvo para purificar selectivamente a proteína. O procedimento envolve a imobilização de um anticorpo para um material da coluna, que então liga seletivamente a proteína, enquanto tudo o resto flui através. A proteína pode ser iludida através da alteração do pH ou da salinidade. Como este método não envolve engenharia em uma tag, ele pode ser usado para proteínas de fontes naturais.

6. HPLC:

cromatografia líquida de alta resolução ou cromatografia líquida de alta pressão é uma forma de cromatografia que aplica alta pressão para conduzir os solutos através da coluna mais rapidamente. Isto significa que a difusão é limitada e a resolução é melhorada. A forma mais comum é HPLC de “fase invertida”, onde o material da coluna é hidrofóbico.

as proteínas são eluídas por um gradiente de aumento de quantidades de um solvente orgânico, como o acetonitrilo. As proteínas eluem de acordo com a sua hidrofobicidade. Após a purificação por HPLC a proteína está em uma solução que só contém compostos voláteis, e pode facilmente ser liofilizado. A purificação do HPLC resulta frequentemente na desnaturação das proteínas purificadas, pelo que não é aplicável às proteínas que não se repitam espontaneamente.