10.4.2 Trehalose voor cryopreservatie van zoogdiercellen
cryopreservatie wordt vaak gebruikt voor het behoud van cellen gedurende langere perioden bij extreem lage temperaturen. Nochtans, kunnen de fysieke veranderingen die tijdens het bevriezen en het ontdooien voorkomen schadelijk aan celoverleving en functies zijn. Vandaar cryoprotectanten moeten aan de cellen tijdens cryopreservatie worden toegevoegd. Het gebruik van trehalose als cryoprotectant voor cellen kwam voort uit de notie dat polyhydroxyverbindingen aan beide zijden van het celmembraan nodig zijn om de cellen langer te bewaren . Trehalose is onderzocht door verscheidene groepen als beschermingsmiddel voor de cryopreservatie van diverse menselijke cellen.
Beattie et al. introduceerde trehalose samen met DMSO in pancreatische langerhanscellen gebruikend thermotropic vloeibare faseovergang . Cryopreservatie met trehalose resulteerde in 92% herstel van volwassen eilandjes, vergeleken met slechts 58% herstel bij gebruik van alleen DMSO. In de transplantaten van met trehalose cryopreserveerde eilandjes werd veertien maal meer insuline gevonden dan in de transplantaten zonder trehalose. Het herstel van menselijke foetale eilandachtige celclusters (ICC ‘ s) die met trehalose werden cryopreserveerd, was 94%, vergeleken met slechts 42% voor degenen zonder trehalose. Bij transplantatie bij naakte muizen werd een 15-voudige toename van het insulinegehalte van transplantaten van ICC-cryopreserveerd met trehalose waargenomen. Deze resultaten wijzen erop dat de toevoeging van trehalose als cryopreservant tot zeer hoge overlevingspercentages van menselijk pancreas endocriene weefsel leidt.
Toner en collega ‘ s introduceerden lage concentraties trehalose in zoogdiercellen met behulp van een genetisch gemanipuleerde versie van het porievormende eiwit alfa-hemolysine, en ontdekten dat intracellulaire trehalose de overleving van deze cellen tijdens cryopreservatie aanzienlijk kan verbeteren . De langetermijn post-thaw overlevingspercentages van cryopreserveerde muizenfibroblasten en humane keratinocyten waren respectievelijk 80% en 70%, bij een intracellulaire trehaloseconcentratie van 0,2 M. Intracellular trehalose werd ook gevonden om gunstig effect op de membraanintegriteit van gedroogde zoogdiercellen te hebben, met meer dan 90% terugwinning van intact plasmamembraan waargenomen bij het drogen en opslaan van de cellen onder milde voorwaarden verscheidene weken .
het effect van trehalose op de cryopreservatie van humane hepatocyten werd onderzocht door Katenz et al. . In kweekmedium ingevroren levercellen met 10% DMSO en 0,2 M trehalose vertoonden een significante verbetering van de levensvatbaarheid en platingefficiëntie van de post-dooicel in vergelijking met alleen DMSO. De aanwezigheid van trehalose tijdens cryopreservatie resulteerde ook in een verhoogd totaal eiwitgehalte in de aangehechte cellen, hogere albuminesecretiespiegels en lagere aspartaataminotransferasespiegels na het ontdooien.
stamcellen zijn belangrijke instrumenten voor het onderzoek naar hematopoëse, de ontwikkeling van nieuwe therapeutische strategieën en modelsystemen voor bepaalde ziekten. Ondanks de ontwikkelingen in cryopreservatie, blijft post-dooi celdood een belangrijke kwestie. Martinetti et al. gebruikte trehalose om zuivere hematopoëtische stam en voorlopercellen van perifeer bloed te cryopreserveren om celverlies te voorkomen dat tijdens het normale verloop van cryopreservatie optreedt . De uitdrukking van de teller CD34 van de oppervlaktestam werd geëvalueerd en 1 m trehalose werd gevonden om betere cryoprotection aan CD34+ cellen met hoger celaantal en cellevensvatbaarheid te verstrekken wanneer vergeleken met de standaard het bevriezen methode gebruikend DMSO. Bovendien behield cryopreservation met trehalose voor kortere en langere periodes de capaciteit van CD34+ cellen om in megakaryopoietic cellen na het ontdooien te onderscheiden. Deze resultaten suggereren de capaciteit van trehalose om de levensvatbaarheid en de functies van stamcellen te behouden wanneer gebruikt als cryoprotectant.
langdurige opslag van rode bloedcellen (RBC ‘ s) en bloedplaatjes met behoud van een hoge mate van levensvatbaarheid heeft belangrijke implicaties voor bloedtransfusie en klinische geneeskunde. Satpathy et al. beschreef een methode voor het laden van RBC ‘ s met trehalose uit een extracellulair medium met behulp van osmotische onbalans en fosfolipide faseovergang die resulteerde in intracellulaire trehaloseconcentraties van 40 mM . Trehalose werd gevonden om osmotische bescherming van RBCs voor langere periodes uit te oefenen. Vriesdrogen van de Trehalose-geladen RBC ‘ s gevolgd door rehydratie resulteerde in 55% overleving met behoud van hun morfologie. De overlevende cellen synthetiseerden ATP en 2,3-difosfoglyceraat (DPG) en hadden lage niveaus van methemoglobine. De activiteit van SOD en catalase en de secundaire structuur van hemoglobine in gevriesdroogde RBCs waren allen zeer gelijkaardig aan die van verse RBCs. Deze studie toonde aan dat de trehalosebelasting voor stabilisatie van hemoglobine werd vereist en een belangrijke stap naar cryopreservatie van RBCs verstrekte.
de normale bewaartijd van humane bloedplaatjes in bloedbanken is 5 dagen waarna ze worden weggegooid, wat resulteert in een chronisch tekort aan bloedplaatjes dat nodig is voor transfusie. Als een poging in de richting van cryopreservatie van bloedplaatjes voor langere periodes, Wolkers et al. beschreven een methode voor het introduceren van trehalose in het cytoplasma van menselijke bloedplaatjes . Trehalose bleek gemakkelijk op te nemen door de menselijke bloedplaatjes bij 37°C met een beladingsefficiëntie van meer dan 50%. Vriesdrogen en rehydrateren van de met trehalose geladen bloedplaatjes resulteerden in een uitstekend herstel van intacte bloedplaatjes met een overlevingskans van 85%. Deze bloedplaatjes reageerden op een bijna identieke manier op verse bloedplaatjes in de richting van agonisten zoals trombine, ADP, collageen en ristocetin. De membraan microdomeinen en eiwitcomponenten van trehalose-geladen bloedplaatjes werden intact gehouden na vriesdrogen en rehydratatie.
het beschermende effect van trehalose werd ook aangetoond in uitgedroogde corneale epitheliale cellen. Pre-incubatie van gekweekte corneale epitheliale cellen met trehalose gevolgd door drogen resulteerde in een significante vermindering van het percentage dode cellen in vergelijking met het controlemedium . Het beschermende effect werd ook ex vivo bevestigd in enucleaire varkensogen, waar het weefsel met trehalose zichtbaar gladder was geïncubeerd . Deze resultaten wijzen op het nut van trehalose in oogheelkunde en zijn potentiële toepassing als oogdruppel voor droog oogsyndroom.Het gebruik van trehalose voor cryopreservatie van organellen is aangetoond door Yamaguchi et al., die trehalose gebruikte als cryoprotectant voor bevroren mitochondriën . Mitochondriën bevroren in aanwezigheid van trehalose vertoonde mitochondriale buitenmembraan (MOM) integriteit en responsiviteit op Bcl-2 familie eiwitten vergelijkbaar met die van verse mitochondriën. De ultra-structuur, ATP-synthese, transmembraanpotentieel, calcium-veroorzaakte zwelling, en de invoer en verwerking van precursorproteã nen werden ook bewaard in aanwezigheid van trehalose. Dit is in tegenstelling tot de standaard sucrose-mannitol buffer gebruikt voor het bevriezen van mitochondriën die vaak lek wordt. Aldus kon trehalose het grootste deel van de biologische eigenschappen van mitochondria behouden en trehalose-bevroren mitochondria kan voor onderzoek naar apoptosis en andere mitochondrial functies worden gebruikt die op MOEDERINTEGRITEIT steunen.
Trehalose wordt gebruikt voor het conserveren van organen gedurende langere perioden. Een” ET-Kyoto-oplossing ” werd ontwikkeld door de Wada-Groep voor het behoud van canine long gedurende >30 uur zonder de prestaties van endotheelcellen en vasculatuur te beïnvloeden . Langdurige stabilisatie en bewaring van vaccins en antilichamen is ook bereikt met trehalose.
