n-terminale sequencing, vaak aangeduid als Edman sequencing of Edman degradatie is een belangrijke techniek in eiwitstudie en blijft een unieke benadering die nieuwe eiwitsequentiegegevens kan opleveren. Het is ook de aangewezen techniek voor snelle eiwituitdrukking bevestiging.
de chemie van deze aanpak werd voor het eerst geïntroduceerd in 1950 door P. Edman van de Universiteit van Lund in Zweden en verder ontwikkeld tijdens zijn werk in Melbourne, Australië tot wat wordt beschouwd als het eerste geautomatiseerde peptide sequencing apparaat.
Edman ‘ s chemistry
Fig 1. Edman degradatiechemie voor n-terminale eiwitsequencing.
de chemische reacties die het gehydroliseerde n-terminaal gelabelde aminozuur opleveren, zijn weergegeven in fig 1. Elke cyclus omvat in wezen 3 stappen:
- koppeling van het fenylisothiocyanaat (PITC, Edman-reagens) aan het Alfa-amine van de polypeptideketen onder basisomstandigheden tot een fenylthiocarbamyl – (PTC) – deel.
- splitsing onder milde zure omstandigheden genereert een vrij amino terminus op het polypeptide en een anilinothiazolinon (ATZ) geadducteerd aminozuur.
- deze laatste wordt geëxtraheerd en verder omgezet in een stabieler fenylthiohydantoïne (PTH) – derivaat.
het resulterende PTH-residu wordt geanalyseerd aan de hand van HPLC en retentietijden in vergelijking met die van standaardpth-aminozuren.
Side reactions and bijproducten
Sequencing cycle chemistry and work up is goed gecontroleerd en levert perfect gedefinieerde soorten op. er zijn enkele bijproducten die tijdens de analyse worden gedetecteerd.
zoals weergegeven in Figuur 2, zijn zij voornamelijk afkomstig van PITC-hydrolyse en methanolyse tijdens de cyclus en omvatten zij difenylthioureum (DPTU), n-fenyl,O-methylthiocarbonaat (PMTC) en difenylureum (DPU), bijproducten die co-extraheren en co-elueren met PTH-aminozuren.
