de TUNEL-test wordt het meest gebruikt om cellen te detecteren die apoptose ondergaan, een vorm van geprogrammeerde celdood. Apoptosis is een belangrijk biologisch proces tijdens ontwikkeling, en voor het handhaven van weefselhomeostase. TUNEL het bevlekken staat voor visualisatie en kwantificering van apoptotic cellen toe. Dit helpt wetenschappers testen werkzaamheid van nieuwe behandelingen voor aandoeningen waarbij apoptose ofwel geremd, zoals bij kanker, of verbeterd, zoals in neurodegeneratie.
deze video zal uitleggen hoe de TUNEL-test kan worden gebruikt om cellen te labelen die apoptose ondergaan, een stap-voor-stap protocol voor het uitvoeren van deze methode in weefselsecties, en hoe onderzoekers deze techniek toepassen om mechanismen van celdood te begrijpen.
voordat we ingaan op het Protocol van de Tunel assay, laten we de principes achter deze techniek bespreken. Een van de vele kenmerken van apoptose is DNA-fragmentatie. Hoe vindt DNA-fragmentatie plaats? Apoptose wordt uitgevoerd door enzymen genoemd caspases huidig in cytosol. Hun primaire rol is proteã nen te splitsen om de cel te ontmantelen. Bovendien activeren caspasen een enzym genaamd caspase-geactiveerde DNase, of CAD, door het los te maken van zijn remmer—ICAD. Geactiveerde CAD is een endonuclease die naar de kern reist en chromosomaal DNA splijt.
splitsing van DNA veroorzaakt uiteindelijk accumulatie van DNA-fragmenten met gekneusde uiteinden, en de TUNEL-test labelt deze gekneusde uiteinden van gefragmenteerd DNA op fluorescente wijze, zodat wetenschappers apoptose kunnen detecteren. Maar hoe kan dit gebeuren? Daarvoor moet je de TUNEL reactie begrijpen. TUNEL staat voor terminale deoxynucleotidyl transferase-gemedieerde dUTP nick-end etikettering. De twee belangrijkste reagentia van TUNEL zijn einddeoxynucleotidyltransferase, of TdT, en deoxyuridinetrifosfaat, of dUTP, die fluorescently voor gemak van opsporing kunnen worden geëtiketteerd.
om de TUNELREACTIE te begrijpen, gaan we terug naar de apoptotische cellen met DNA-fragmenten. Deze gekneusde fragmenten hebben Vrije 3 ‘ hydroxylgroepen. Zodra u de reagentia van TUNEL aan een steekproef toevoegt die apoptotische cellen bevatten, hechten de fluorescently geëtiketteerde dUTPs aan deze 3 ‘ hydroxylgroepen met behulp van het katalysatorenzym TdT. De cellen bevlekt gebruikend deze procedure worden genoemd TUNEL positieve cellen, die dan kunnen worden gevisualiseerd gebruikend de fluorescentiemicroscopie.
nu u de basisprincipes en concepten achter de TUNEL-test begrijpt, schetsen we een algemeen protocol voor het uitvoeren van deze techniek in weefselsecties. De belangrijkste stappen van de Tunel-analyse omvatten het bevestigen van het weefsel van belang, permeabilisatie van het weefsel, het toevoegen van TUNEL-reagentia, het stoppen van de TUNEL-reactie, en tenslotte de analyse.
Ten eerste moet het betrokken Weefsel gefixeerd zijn om de biologische structuren te behouden. De fixatie werkt door proteã NEN binnen cellen te crosslinken. Voor de TUNEL-analyse kunnen weefsels worden bevestigd door ze toe te voegen aan een oplossing die 4% paraformaldehyde bevat gedurende 4-24 uur bij 4°C. Na fixatie, cryosectie het weefsel in dunne plakjes van 10 µm of minder.
de volgende stap is permeabilisatie, waardoor reagentia zoals het TDT-enzym in de celkern kunnen doordringen. Permeabilisatie van weefselsecties kan worden uitgevoerd door het weefsel toe te voegen aan proteïnase K-oplossing gedurende 5-15 minuten bij 37°C. weefselsecties spoelen met fosfaatgebufferde zoutoplossing op een orbitale shaker gedurende 15-30 minuten bij kamertemperatuur.
na permeabilisering worden het TDT-enzym en fluorescerend geëtiketteerde dUTPs toegevoegd aan de weefselsecties, samen met een etiketteringsbuffer die kobalt bevat dat als cofactor voor de TUNELREACTIE fungeert. Samen, worden het TUNEL reactiemengsel en de weefselsectie geïncubeerd 1-3 uren bij 37°C, en beschermd tegen licht om de fluorescentie te verhinderen vervagen.
na incubatie wordt een stopbuffer toegevoegd aan het weefselgedeelte om de TUNELREACTIE te stoppen, en na een korte incubatie worden de secties gewassen met een fosfaatgebufferde zoutoplossing. Tenslotte worden weefselsecties gekleurd gebruikend fluorescently geëtiketteerd dUTP gevisualiseerd gebruikend fluorescentiemicroscopie, en beoordeeld voor localisatie van TUNEL positieve cellen binnen een bepaald weefsel. Men kan celdood eenvoudig kwantificeren door het percentage TUNEL positieve cellen in een gegeven weefselsectie te tellen.
Nu u hebt gezien hoe u de TUNEL-test kunt uitvoeren om apoptotische cellen te detecteren, zullen we bespreken hoe deze test kan worden gebruikt om vragen van celbiologen te beantwoorden.
celdood komt voor als een normaal onderdeel van de ontwikkeling voor het beeldhouwen van weefsels en structuren en voor de eliminatie van onnodige cellen. Daarom bestuderen wetenschappers die geïnteresseerd zijn in dit fenomeen het effect van prenatale blootstelling aan verschillende stoffen op apoptose tijdens de ontwikkeling. Hier waren wetenschappers geïnteresseerd in het onderzoeken van het effect van prenatale blootstelling aan alcohol op de ontwikkeling van de hersenen. De resultaten van TUNEL kleuring uitgevoerd op foetale hersenen onthulde verhoogde apoptose in weefsels die prenataal werden blootgesteld aan alcohol, in vergelijking met controledieren.
wetenschappers gebruiken ook de TUNEL-test om apoptose als reactie op bacteriële infectie te onderzoeken. In dit experiment ontwikkelden wetenschappers een model van longontsteking door muizen te injecteren met Pseudomonas aeruginosa, wat longontsteking veroorzaakt. Vervolgens werd longweefsel verwijderd en TUNEL kleuring werd uitgevoerd om apoptose te onderzoeken in reactie op de bacteriële infectie. De resultaten tonen aan dat apoptotische celdood toenam bij muizen die aan de bacteriën werden blootgesteld, in vergelijking met controledieren.
ten slotte kan TUNEL kleuring worden gebruikt op humane tumormonsters om de respons van de tumor op geneesmiddelen te bepalen. In dit voorbeeld, werden tumormonsters geoogst van menselijke patiënten en ex vivo gekweekt. Vervolgens werden ze behandeld met preklinische geneesmiddelen en beoordeeld op een respons met behulp van de Tunel assay. De verkregen gegevens tonen aan dat de behandeling met een medicijn dat hitteschok proteïne 90 remt, apoptose in tumorweefsel aanzienlijk verhoogt.
u hebt zojuist JoVE ‘ s video bekeken over het gebruik van de TUNEL assay om cellen te detecteren die apoptose ondergaan. Deze video besprak de principes achter TUNEL kleuring, en een stap-voor-stap protocol om de TUNEL assay uit te voeren op weefselsecties. We bespraken ook hoe deze methode kan worden toegepast om geprogrammeerde celdood tijdens ontwikkeling en ziekte te begrijpen. Zoals altijd, bedankt voor het kijken!
