Multi-color kleuring met fluorescente kleurstoffen wordt actief gebruikt voor het observeren van de distributie van biologische materialen (zoals eiwitten, lipiden, nucleïnezuren en ionen) op het gebied van weefsel-en celonderzoek. De opsporingstechnologie voor fluorescentiewaarneming is tot een niveau gevorderd waarbij één enkele fluorescente kleurstofmolecuul onder de beste omstandigheden kan worden ontdekt. Deze sectie behandelt verscheidene belangrijke aspecten van de de weergavemicroscopie van het fluorescentieleven (FLIM), een nieuwe technologie van de fluorescentiemicroscopie. Naast multi-color het bevlekken, kan de weergave van het fluorescentieleven ook worden gebruikt om de factoren te visualiseren die de eigenschappen van het fluorescentieleven van de kleurstofmolecuul beà nvloeden, dat wil zeggen, de staat van het milieu rond de molecule.
Golflengtespectroscopie
conventionele fluorescentiemicroscopie maakt gebruik van de kleureigenschappen van fluorescerende kleurstoffen, dat wil zeggen de identificatie is gebaseerd op verschillen in fluorescentiespectrale kenmerken tussen kleurstoffen. Met deze techniek, kunnen vijf of zes kleurstoffen in de golflengtewaaier van ultraviolet aan dichtbij infrarood gelijktijdig onder microscopie zonder verwarring tussen kleuren worden gebruikt.
Levensduurspectroscopie
elke fluorescerende kleurstof heeft zijn eigen levensduur in opgewonden toestand. Door verschillen in leven te ontdekken, is het mogelijk om zelfs kleurstoffen te onderscheiden die dezelfde fluorescente kleur hebben evenals autofluorescentie te identificeren. Voorts kunnen de hoge signaal-aan-lawaai beelden worden verkregen door een sonde met zeer lang leven te gebruiken in vergelijking met dat van de normaal gebruikte fluorescente kleurstoffen. Bijvoorbeeld, heeft platina coproporphyrine een leven van milliseconde orde terwijl de levens van gewone fluorescente kleurstoffen van nanoseconde orde zijn. Dergelijke relatief langlevende fluorescente kleurstoffen zullen binnenkort worden gebruikt als sondes voor DNA-detectie op chips.
de levensduurweergave van de fluorescentie maakt het ook mogelijk om informatie over de moleculen te verkrijgen terwijl een levende cel wordt geobserveerd. De factoren die het fluorescentieleven beà nvloeden omvatten ionenintensiteit, hydrophobic eigenschappen, zuurstofconcentratie, moleculaire band, en moleculaire interactie door energieoverdracht wanneer twee proteã nen elkaar benaderen. Het leven is, echter, onafhankelijk van kleurstofconcentratie, het photobleaching, het lichte verspreiden en de intensiteit van het opwindingslicht. Daarom staat de weergave van het fluorescentieleven ons toe om nauwkeurige ionenconcentratiemeting en de overdracht van de Fluorescentieresonantieenergie (lijstwerk) analyse uit te voeren.
er zijn twee methoden voor fluorescentie lifetime imaging: de tijddomeinmethode en de frequentiedomeinmethode.
- Tijddomeinflim – in sommige gevallen van vertraging na excitatie met een pulslaser kan het fluorescentiebeeld worden verkregen door de poortbediening van de beeldversterker. Het leven wordt gemeten in nanoseconden door een laser met een pulsduur van een paar honderd picoseconden en een nanoseconde-niveau sluitertijd omdat het leven van een opwindingstoestand gewoonlijk 1 tot 20 nanoseconden is. Een high-speed gate beeldversterker is in de handel verkrijgbaar bij Hamamatsu Photonics K. K. (Hamamatsu, Japan). Het fluorescentieleven bij elke pixel kan ook worden verkregen door de vertragingstijd te meten terwijl een poort wordt geopend. De beelden van het fluorescentieleven worden getoond in pseudocolor volgens hun levens.
- de levensduur van het frequentiedomein FLIM-fluorescentie wordt berekend door de faseverschuiving van de fluorescentie en de vermindering van de amplitude te meten met behulp van een detector met een versterkingsmodulator wanneer de laser die wordt gebruikt als prikkellichtbron wordt gemoduleerd (1 tot 200 megahertz). De meting kan worden uitgevoerd door middel van laserscanning (fotomultiplicator) of met behulp van een charge-coupled device (CCD).
toepassingen
de omgeving rond de sonde wordt gedetecteerd op basis van het feit dat de levensduur van de fluorescentie gevoelig is voor waterstofionenconcentratie (pH), zuurstof en calciumionconcentraties. De band of de interactie tussen molecules kan ook in combinatie met lijstwerk worden gemeten.
beeldvorming van de Calciumionconcentratie
wanneer het calciumion bindt aan een fluorescerende sonde zoals Fura-2, Fluo-3 of Calciumgroen, veranderen zowel de levensduur van de fluorescentie als de intensiteit van de fluorescentie. De conventionele methode voor het meten van de ionenconcentratie richt zich op de verandering in intensiteit. Volgens de verandering van de calciumionenconcentratie, verandert de verhouding van kleurstoffen tussen gebonden en ongebonden calciumion, en dit leidt later tot een verandering in het fluorescentieleven van de meetvlek in het specimen. Naast de calciumionensonde is deze techniek ook van toepassing op de meting van pH en andere ionen zoals natriumion en magnesiumion.
fluorescentie resonantie energie overdracht (FRET)
onderzoek wordt momenteel uitgevoerd op FRET door groene fluorescerende eiwit (GFP) varianten (GFP met een andere fluorescentie kleur). Lijstwerk maakt het mogelijk om de interactie (vereniging of dissociatie) tussen twee proteã nen te meten die met een paar fluorescentiekleurstoffen worden geëtiketteerd. Een fluorescente kleurstof van de donor heeft kortere opwinding / emissiegolflengten die energie aan een kleurstof van de acceptorfluorescentie verstrekken. De levensduur van de opwindingstoestand van de donorkleurstof is afhankelijk van het al dan niet bestaan van de acceptor (de kleurstof die de energie ontvangt). Meting die op leven wordt gebaseerd staat betere kwantificering toe omdat het niet noodzakelijk is om de overlapping van fluorescentie tijdens opsporing te overwegen.
klinische beeldvorming
aangezien sommige weefsel-en cytodiagnostische specimens een sterke autofluorescentie hebben, is geprobeerd sondes met een lange levensduur (tot milliseconden) te gebruiken. De sondes van het lange leven zijn ook nuttig in fluorescentie in situ kruising (vissen) omdat het aantal kleuren dat gelijktijdig met deze techniek kan worden gebruikt beperkt is. De waterstofionenconcentratie in het bloed, evenals de zuurstof-en kooldioxidedruk, zijn reeds gemeten op basis van fluorescentielevensduur, hoewel dergelijke metingen nog steeds niet mogelijk zijn onder microscopie.
internetbronnen
- Centrum voor Fluorescentiespectroscopie-gehost door Professor Joseph R. Lakowicz aan de Universiteit van Maryland, deze website is een uitstekende bron voor informatie over fluorescentie lifetime imaging en andere aspecten van fluorescentie spectroscopie en microscopie.Kentech Instruments-Kentech produceert hoogspanningspulsgeneratoren en optische gated imaging systemen voor levenslange fluorescentie beeldvorming.
- Hamamatsu Fotonica-naast hun uitstekende assortiment digitale camerasystemen, produceert Hamamatsu ook fotomultipliers, lawinefoto ‘ s en beeldversterkers met hoge snelheid.PRS BioSciences-gespecialiseerd in biologische fluorescentiemicroscopie, produceert PRS BioSciences een aftermarket time-gated systeem dat kan worden aangepast aan vele onderzoeksmicroscopen.
