G418

G418 (Geneticin, Invitrogen): Oplossen in water van 200 mg/ml, filter steriliseren, en op te slaan in aliquots bij 4 °C.

clonNAT (nourseothricin, Werner BioAgents, Jena, Duitsland): Oplossen in water bij 100 mg/ml, filter steriliseren, en op te slaan in aliquots bij 4 °C.

Canavanine (l-canavanine sulfaat zout, Sigma, C-9758): Oplossen in water bij 100 mg/ml, filter steriliseren, en op te slaan in aliquots bij 4 °C.

Thialysine (N-(2-aminoethyl)-l-cysteïne hydrochloride, Sigma, A-2636): Dissolve in water at 100 mg/ml, filter sterilize, and store in aliquots at 4 °C.

Amino acids supplement powder mixture for synthetic media (complete): Contains 3 g adenine (Sigma), 2 g uracil (ICN), 2 g inositol, 0.2 g para-aminobenzoic acid (Acros Organics), 2 g alanine, 2 g arginine, 2 g asparagine, 2 g aspartic acid, 2 g cysteine, 2 g glutamic acid, 2 g glutamine, 2 g glycine, 2 g histidine, 2 g isoleucine, 10 g leucine, 2 g lysine, 2 g methionine, 2 g phenylalanine, 2 g proline, 2 g serine, 2 g threonine, 2 g tryptophan, 2 g tyrosine, and 2 g valine (Fisher). Drop-out (DO) poedermengsel is een combinatie van de bovenstaande ingrediënten minus de juiste aanvulling. Twee gram van het do poedermengsel wordt gebruikt per liter medium.

aminozuren supplement voor sporulatiemedium: bevat 2 g histidine, 10 g leucine, 2 g lysine, 2 g uracil; 0,1 g van het aminozuursupplement poedermengsel wordt gebruikt per liter sporulatiemedium.

Glucose (Dextrose, Fisher): 40% – oplossing bereiden, autoclaaf en bij kamertemperatuur bewaren.

YEPD: Voeg 120 mg adenine( Sigma), 10 g gistextract, 20 g pepton, 20 g bacto agar (Bd Difco) toe aan 950 ml water in een 2 l kolf. Voeg na het autoclaveren 50 ml 40% glucose-oplossing toe, meng grondig, laat afkoelen tot ~ 65 °C en giet platen.

YEPD + G418: koel YEPD-medium tot ~ 65 °C, voeg 1 ml g418-stamoplossing (eindconcentratie 200 mg/l) toe, meng grondig en giet platen.

YEPD + clonNAT: koel YEPD-medium tot ~ 65 °C, voeg 1 ml clonnat-stamoplossing (eindconcentratie 100 mg/l) toe, meng grondig en giet platen.

YEPD + G418 / clonNAT: Koel YEPD-medium tot ~ 65 °C, voeg 1 ml G418 (eindconcentratie 200 mg/l) en 1 ml clonNAT (eindconcentratie 100 mg/l) stamoplossingen toe, meng grondig en giet platen.

verrijkte sporulatie: voeg 10 g kaliumacetaat (Fisher), 1 g gistextract, 0,5 g glucose, 0,1 g aminozuursupplementpoeder voor sporulatie, 20 g bacto-agar toe aan 1 L water in een 2 l kolf. Na het autoclaveren het medium afkoelen tot ~ 65 °C, 250 µl g418-stamoplossing (eindconcentratie 50 mg/l) toevoegen, grondig mengen en platen gieten.

(SD/MSG) − His/Arg/Lys + canavanine/thialysine/G418: voeg 1,7 g giststikstofbase zonder aminozuren of ammoniumsulfaat (Bd Difco) toe, 1 g MSG (L-glutaminezuur natriumzout, hydraat, Sigma), 2 g aminozuursupplementpoeder (DO − His/Arg/Lys), 100 ml water in een kolf van 250 ml. Voeg 20 g bacto-agar toe aan 850 ml water in een kolf van 2 l. Autoclaaf apart. Combineer autoclaafoplossingen, voeg 50 ml 40% glucose toe, koel medium tot ~ 65 °C, voeg 0,5 ml canavanine (50 mg/l), 0,5 ml thialysine (50 mg/l) en 1 ml g418 (200 mg/l) voorraadoplossingen toe, meng grondig en giet platen. Ammoniumsulfaat belemmert de functie van g418 en clonNAT. Daarom wordt synthetisch medium dat deze antibiotica bevat gemaakt met mononatriumglutaminezuur als stikstofbron (Cheng et al., 2000).

(SD/MSG) − His/Arg/Lys + canavanine/thialysine/clonNAT: voeg 1,7 g giststikstofbase zonder aminozuren of ammoniumsulfaat, 1 g MSG, 2 g aminozuren supplement poedermengsel (DO − His/Arg/Lys), 100 ml water in een 250 ml kolf. Voeg 20 g bacto-agar toe aan 850 ml water in een kolf van 2 l. Autoclaaf apart. Combineer autoclaafoplossingen, voeg 50 ml 40% glucose toe, koel medium tot ~ 65 °C, voeg 0 toe.5 ml canavanine (50 mg/l), 0,5 ml thialysine (50 mg/l) en 1 ml clonNAT (100 mg/l) stamoplossingen, grondig mengen en platen gieten.

(SD/MSG) − His/Arg/Lys + canavanine/thialysine/G418/clonNAT: voeg 1,7 g giststikstofbase zonder aminozuren of ammoniumsulfaat, 1 g MSG, 2 g aminozuursupplementpoeder (DO − His/Arg/Lys), 100 ml water toe in een kolf van 250 ml. Voeg 20 g bacto-agar toe aan 850 ml water in een kolf van 2 l. Autoclaaf apart. Combineer autoclaaf oplossingen, voeg 50 ml 40% glucose, koel medium tot ~ 65 °C, voeg 0,5 ml Canavanine (50 mg/l), 0.5 ml thialysine (50 mg/l), 1 ml G418 (200 mg/l) en 1 ml clonNAT (100 mg/l) stamoplossingen, grondig mengen en platen gieten.

(SD/MSG) compleet: voeg 1,7 g giststikstofbase zonder aminozuren of ammoniumsulfaat, 1 g MSG, 2 g aminozuursupplementpoeder (compleet), 100 ml water toe in een kolf van 250 ml. Voeg 20 g bacto-agar toe aan 850 ml water in een kolf van 2 l. Autoclaaf apart. Combineer autoclaafoplossingen, voeg 50 ml 40% glucose toe, meng grondig, koel medium tot ~ 65 °C en giet platen.

SD-His/Arg / Lys + canavanine / thialysine: Add 6.7 g giststikstofbase zonder aminozuren (Bd Difco), 2 g aminozuren supplement poedermengsel (DO − His/Arg/Lys), 100 ml water in een 250 ml kolf. Voeg 20 g bacto-agar toe aan 850 ml water in een kolf van 2 l. Autoclaaf apart. Combineer autoclaafoplossingen, voeg 50 ml 40% glucose toe, koel medium tot ~ 65 °C, voeg 0,5 ml canavanine (50 mg/l) en 0,5 ml thialysine (50 mg/l) stamoplossingen toe, meng grondig en giet platen. Dit medium bevat geen antibiotica zoals g418 of clonNAT en daarom wordt ammoniumsulfaat gebruikt als stikstofbron.

SD-Leu/Arg / Lys + canavanine / thialysine: voeg 6,7 g giststikstofbase zonder aminozuren toe, 2 g aminozuursupplementpoeder (DO-Leu/Arg / Lys), 100 ml water in een kolf van 250 ml. Voeg 20 g bacto-agar toe aan 850 ml water in een kolf van 2 l. Autoclaaf apart. Combineer autoclaafoplossingen, voeg 50 ml 40% glucose toe, koel medium tot ~ 65 °C, voeg 0,5 ml canavanine (50 mg/l) en 0,5 ml thialysine (50 mg/l) stamoplossingen toe, meng grondig en giet platen.