Methoden van Eiwitzuivering: 4 methoden

dit artikel werpt licht op de vier methoden van eiwitzuivering.

de vier methoden voor eiwitzuivering zijn: (1) extractie (2) precipitatie en differentiële Oplosbaarheid (3)Ultracentrifugatie en (4) chromatografische methoden.

de bij de eiwitzuivering gebruikte methoden kunnen ruwweg worden onderverdeeld in analytische en preparatieve methoden.

het onderscheid is niet exact, maar de beslissende factor is de hoeveelheid eiwit, die met deze methode praktisch kan worden gezuiverd. Analytische methoden zijn gericht op het detecteren en identificeren van een eiwit in een mengsel, terwijl voorbereidende methoden gericht zijn op het produceren van grote hoeveelheden van het eiwit voor andere doeleinden, zoals structurele biologie of industrieel gebruik. In het algemeen kunnen de preparatieve methoden worden gebruikt in analytische toepassingen, maar niet andersom.

Methode # 1. Extractie:

afhankelijk van de bron moet het eiwit in de oplossing worden gebracht door het weefsel of de cellen die het bevatten te breken. Er zijn verschillende methoden om dit te bereiken; herhaald bevriezen en ontdooien, sonicatie, homogenisatie door hoge druk of permeabilization door organische oplosmiddelen. De methode van keuze hangt af van hoe fragiel de proteã ne is en hoe stevig de cellen zijn.

na dit extractieproces zal oplosbaar eiwit in het oplosmiddel zitten en kan worden gescheiden van celmembranen, DNA, enz. door centrifugeren. Het extractieproces extraheert ook proteasen, die de eiwitten in de oplossing gaan verteren. Als het eiwit gevoelig is voor proteolyse, is het meestal wenselijk om snel verder te gaan en het extract gekoeld te houden, om de proteolyse te vertragen.

Methode # 2. Precipitatie en differentiële Oplosbaarheid:

bij bulkzuivering van eiwitten is precipitatie met ammoniumsulfaat (NH4)2SO4 een veel voorkomende eerste stap om eiwitten te isoleren. Dit wordt uitgevoerd door het toevoegen van toenemende hoeveelheden ammoniumsulfaat en het verzamelen van de verschillende fracties van precipitaateiwit. Een voordeel van deze methode is dat het goedkoop kan worden uitgevoerd met zeer grote volumes.

de eerste proteã nen die worden gezuiverd zijn in water oplosbare proteã nen. De zuivering van integrale membraanproteã nen vereist verstoring van het celmembraan om om het even welke bepaalde proteã ne van anderen te isoleren die in het zelfde membraancompartiment zijn. Soms kan een bepaalde membraantractie eerst worden geà soleerd, zoals het isoleren van mitochondriën van cellen alvorens een eiwit in een mitochondriaal membraan te zuiveren.

een detergens zoals natriumdodecylsulfaat (SDS) kan worden gebruikt om celmembranen op te lossen en membraaneiwitten in oplossing te houden tijdens de zuivering; omdat SDS denaturatie veroorzaakt, kunnen mildere detergentia zoals Triton X-100 of CHAPS worden gebruikt om de oorspronkelijke bouw van het eiwit tijdens de zuivering te behouden.

Methode # 3. Ultracentrifugeren:

centrifugeren is een proces waarbij gebruik wordt gemaakt van centrifugale kracht om mengsels van deeltjes van verschillende massa ‘ s of dichtheden, gesuspendeerd in een vloeistof, te scheiden. Wanneer een schip (typisch een buis of fles) dat een mengsel van proteã NEN of andere corpusculaire kwestie, zoals bacteriële cellen bevat, bij hoge snelheden wordt geroteerd, levert het impulsmoment een uitgaande kracht aan elk deeltje op dat aan zijn massa evenredig is.

de neiging van een bepaald deeltje om door de vloeistof te bewegen als gevolg van deze kracht wordt gecompenseerd door de weerstand die de vloeistof op het deeltje uitoefent. Het netto effect van het” spinnen “van het monster in een centrifuge is dat massieve, kleine en dichte deeltjes sneller naar buiten bewegen dan minder massieve deeltjes of deeltjes met meer” slepen ” in de vloeistof.

wanneer suspensies van deeltjes in een centrifuge worden” gesponnen”, kan zich op de bodem van het vat een “pellet” vormen die is verrijkt voor de meest massieve deeltjes met een geringe weerstand in de vloeistof. De resterende, niet-verdichte deeltjes nog steeds meestal in de vloeistof worden de “supernatant” genoemd en kan uit het vat worden verwijderd om de supernatant van de pellet te scheiden.

de centrifugatiesnelheid wordt bepaald door de hoekversnelling die op het monster wordt toegepast, doorgaans gemeten in vergelijking met de g. als de monsters lang genoeg worden gecentrifugeerd, zullen de deeltjes in het vat een evenwicht bereiken waarbij de deeltjes zich specifiek op een punt in het vat accumuleren waar hun drijfdichtheid in evenwicht is met de centrifugale kracht. Een dergelijke” evenwicht ” centrifugering kan een uitgebreide zuivering van een bepaald deeltje mogelijk maken.

Sucrose gradiëntcentrifugering:

een lineaire concentratiegradiënt van suiker (meestal sucrose glycerol, of Percoll) wordt gegenereerd in een buis, zodat de hoogste concentratie aan de onderkant en de laagste aan de bovenkant. Een eiwitmonster wordt dan bovenop de gradiënt gelaagd en bij hoge snelheden in een ultracentrifuge gesponnen. Dit veroorzaakt zware macromoleculen om naar de bodem van de buis sneller dan lichter materiaal te migreren.

bij centrifugeren zonder sucrose ervaren deeltjes die zich steeds verder van het draaipunt verplaatsen, steeds meer centrifugale kracht (hoe verder ze bewegen, hoe sneller ze bewegen). Het probleem hiermee is dat het nuttige scheidingsbereik binnen het schip beperkt is tot een klein waarneembaar venster.

het spinnen van een monster twee keer zo lang betekent niet dat het deeltje van belang twee keer zo ver zal gaan; in feite zal het aanzienlijk verder gaan. Nochtans wanneer de proteã nen door een sucrose gradiënt bewegen, ontmoeten zij vloeistof van stijgende dichtheid en viscositeit.

een goed ontworpen sucrose-gradiënt zal de toenemende centrifugale kracht tegengaan, zodat de deeltjes in nauwe verhouding bewegen tot de tijd dat ze in het centrifugale veld zijn geweest. Monsters die door deze gradiënten worden gescheiden, worden “snelheidszonale” centrifugaties genoemd. Na het scheiden van de proteã ne / deeltjes, wordt de gradiënt dan gefractioneerd en verzameld.

Methode # 4. Chromatografische methoden:

gewoonlijk bevat een eiwitzuiveringsprotocol een of meer chromatografische stappen. De basisprocedure in chromatografie moet de oplossing die de proteã ne bevatten door een kolom stromen die met diverse materialen wordt ingepakt. De verschillende proteã nen interageren verschillend met het kolommateriaal, en kunnen zo door de tijd worden gescheiden die wordt vereist om de kolom over te gaan, of de voorwaarden worden vereist om de proteã ne uit de kolom te elute. Gewoonlijk worden de proteã nen ontdekt aangezien zij van de kolom door hun absorptie bij 280 nm komen.

er bestaan veel verschillende chromatografische methoden:

1. De chromatografie van de grootteuitsluiting:

de chromatografie kan worden gebruikt om proteã ne in oplossing of denatureringsvoorwaarden te scheiden met behulp van poreuze gels. Deze techniek is genoemd geworden chromatografie van de grootteuitsluiting. Het principe is dat kleinere moleculen een groter volume in een poreuze matrix moeten doorlopen. Consequentially, zullen de proteã nen van een bepaalde waaier in grootte een veranderlijk volume eluant (oplosmiddel) vereisen alvorens aan het andere eind van de kolom van gel wordt verzameld.

in het kader van eiwitzuivering wordt het eluant gewoonlijk in verschillende reageerbuisjes gepoold. Alle reageerbuisjes die geen meetbaar spoor van het te zuiveren eiwit bevatten, worden weggegooid. De overblijvende oplossing wordt aldus gemaakt van de te zuiveren proteã ne en om het even welke andere op gelijke grootte proteã nen.

2. Ionenwisselchromatografie:

Ionenwisselchromatografie scheidt verbindingen afhankelijk van de aard en de mate van hun Ionische lading. De te gebruiken kolom wordt geselecteerd op basis van het type en de sterkte van de lading. De harsen van de anionenuitwisseling hebben een positieve last en worden gebruikt om negatief geladen com ponden te behouden en te scheiden, terwijl de harsen van de kationenuitwisseling een negatieve last hebben en worden gebruikt om positief geladen molecules te scheiden.

voordat de scheiding begint wordt een buffer gepompt door de kolom om de tegengestelde geladen ionen in evenwicht te brengen. Op injectie van de steekproef, zullen de opgeloste molecules met de bufferionen uitwisselen aangezien elk voor de bandplaatsen op de hars concurreert. De lengte van de retentie voor elke opgeloste stof hangt af van de sterkte van de lading.

de meest zwak geladen verbindingen zullen eerst elueren, gevolgd door verbindingen met achtereenvolgens sterkere ladingen. Wegens de aard van het het scheiden mechanisme, spelen pH, buffertype, bufferconcentratie, en temperatuur allen belangrijke rollen in het controleren van de scheiding. De ionenuitwisseling chromatografie is een zeer krachtig hulpmiddel voor gebruik in eiwitreiniging en wordt vaak gebruikt in zowel analytische als preparatieve scheidingen.

3. Chromatografie Van Affiniteit:

Affiniteitschromatografie is een scheidingstechniek op basis van moleculaire bouw, waarbij vaak gebruik wordt gemaakt van toepassingsspecifieke harsen. Deze harsen hebben ligands in bijlage aan hun oppervlakten die voor de te scheiden samenstellingen specifiek zijn. Het vaakst, functioneren deze ligands op een manier gelijkend op dat van antilichaam-antigeeninteractie. Dit “slot en zeer belangrijke” pasvorm tussen ligand en zijn doelsamenstelling maakt het hoogst specifiek, vaak genererend één enkele piek, terwijl al anders in de steekproef un-behouden is.

veel membraaneiwitten zijn glycoproteïnen en kunnen worden gezuiverd door chromatografie met lectine-affiniteit. De oplosbare proteã nen van het detergens kunnen worden toegestaan om aan een chromatografiehars te binden die is gewijzigd om een covalent in bijlage lectine te hebben.

Eiwitten die binden aan de lectine zijn weggespoeld en dan specifiek gebonden glycoproteïnen kan worden geëlueerd door het toevoegen van een hoge concentratie van suiker, dat concurreert met de gebonden glycoproteïnen in het bindend lectine site. Sommige lectins hebben hoge affiniteit die aan oligosaccharides van glycoproteã NEN binden die moeilijk met suikers is te concurreren, en de bindende glycoproteã NEN moeten door het lectine te denatureren worden vrijgegeven.

4. Metaalbinding:

een veelgebruikte techniek bestaat uit het ontwikkelen van een sequentie van 6 tot 8 histidines in de C-terminal van het eiwit. Het polyhistidine bindt sterk aan divalente metaalionen zoals nikkel en kobalt. De proteã ne kan door een kolom worden overgegaan die geïmmobiliseerde nikkelionen bevat, die de polyhistidinemerk bindt. Alle ongedetagde eiwitten gaan door de kolom.

het eiwit kan worden geëlueerd met imidazol, dat concurreert met het polyhistidine label voor binding aan de kolom, of door een afname van de pH (meestal tot 4,5), waardoor de affiniteit van het label voor de hars afneemt. Hoewel deze procedure over het algemeen wordt gebruikt voor de zuivering van recombinante proteã nen met een geconstrueerde affiniteitsmarkering (zoals een 6xhis-markering of Clontech ‘ s HAT tag), kan het ook worden gebruikt voor natuurlijke proteã nen met een inherente affiniteit tor divalente kationen.

5. Immunoaffiniteit Chromatografie:

Immunoaffiniteitschromatografie maakt gebruik van de specifieke binding van een antilichaam aan het doeleiwit om het eiwit selectief te zuiveren. De procedure impliceert het immobiliseren van een antilichaam aan een kolommateriaal, dat dan selectief de proteã ne bindt, terwijl al het andere door stroomt. Het eiwit kan Ix geëlueerd door het veranderen van de pH of het zoutgehalte. Omdat deze methode geen techniek in een markering impliceert, kan het voor proteã nen van natuurlijke bronnen worden gebruikt.

6. HPLC:

hogedrukvloeistofchromatografie of hogedrukvloeistofchromatografie is een vorm van chromatografie waarbij hoge druk wordt uitgeoefend om de opgeloste stoffen sneller door de kolom te drijven. Dit betekent dat de verspreiding beperkt is en de resolutie verbeterd is. De gemeenschappelijkste vorm is” omgekeerde fase ” HPLC, waar het kolommateriaal hydrophobic is.

de eiwitten worden geëlueerd door een gradiënt van toenemende hoeveelheden van een organisch oplosmiddel, zoals acetonitril. De proteã nen elueren volgens hun hydrophobicity. Na zuivering door HPLC is de proteã ne in een oplossing die slechts vluchtige samenstellingen bevat, en gemakkelijk kan worden gevriesdroogd. De zuivering van HPLC resulteert vaak in denaturatie van de gezuiverde proteã nen en is dus niet van toepassing op proteã nen die niet spontaan opnieuw vouwen.