Moleculaire detectie van toxigene C difficile: toxine A of B gen?

Clostridium difficile infecties (CDI ‘ s) zijn de belangrijkste oorzaak van in het ziekenhuis verworven diarree, voornamelijk bij patiënten blootgesteld aan antibiotica. Infecties zijn in verband gebracht met langdurige ziekenhuisverblijven en aanzienlijke gezondheidskosten. Recente veranderingen in de epidemiologie van CDI omvatten een verhoogde incidentie en ernst van de ziekte, deels als gevolg van het ontstaan van de (BI/NAP1/027) stam die nu endemisch is in veel Amerikaanse ziekenhuizen.1 clinici hebben ook verhoogde infecties waargenomen bij populaties met een eerder laag risico en gevallen van in de gemeenschap verworven CDI in afwezigheid van traditionele risicofactoren.

alleen toxineproducerende C-diff-stammen veroorzaken ziekte en toxinen A en B (gecodeerd door de tcda-en tcdb-genen) lijken een belangrijke rol te spelen. De toxines zijn pro-inflammatoire enterotoxinen, maar toxine B is een krachtiger cytotoxine.2 directe cytotoxiciteit van de ontlasting, die toxine B detecteert, was de eerste klinisch bruikbare diagnostische test die werd ontwikkeld. In de vroege jaren 1990, werden de snelle enzym immunoassays (EIAs) ontwikkeld om toxine A te ontdekken die immunogenischer is dan toxine B. vele laboratoria namen deze analyses aan omdat zij geschikt en gemakkelijker te gebruiken waren.

in 2000 waren uitbraken van ernstige gevallen van CDI door stammen zonder toxine A (A-B+ varianten) de eerste aanwijzing dat toxine A niet essentieel was voor de klinische ziekte.3,4 CDI patiënten met deze variant stammen werden verkeerd gediagnosticeerd omdat hun ontlastingsmonsters negatief waren door toxine A-specifieke EIAs.Bij gebrek aan geschikte behandeling ontwikkelden sommige patiënten ernstige CDI-complicaties met slechte resultaten, waaronder overlijden.3,4 als reactie op de opkomst van toxine A-negatieve variant C diff stammen ontwikkelden kit fabrikanten nieuwe EIAs die ook toxine B detecteerden omdat het niet langer aanvaardbaar was om toxine A alleen te detecteren.

het merendeel van de ziekteveroorzakende toxine C diff produceert beide toxinen. Toxine A-B+ stammen zijn echter goed voor 2% tot 11% van de CDI-cases5, met hogere schattingen in Ierland6 en Azië.7 deze stammen, die worden gekenmerkt als het hebben van grote deleties in het tcda gen veroorzaken hetzelfde ziektespectrum als die beide toxines produceren, variërend van milde diarree tot pseudomembraneuze colitis.4 sommige rapporten suggereren echter dat de ziekte veroorzaakt door toxine A-B+ stammen waarschijnlijk ernstiger is.7

daarentegen zijn meldingen van in de natuur voorkomende ziekteveroorzakende stammen die geen toxine B produceren (toxine A+B-varianten) uiterst zeldzaam. Het enige rapport in de literatuur van infectie met een A+B – stam was een patiënt met recidiverende CDI, van wie C diff isolaten met zowel tcda als tcdb genen eerder geïsoleerd waren.8 ontlasting monsters van de patiënt tijdens de voorafgaande diarree episodes waren positief voor toxine B door een cytotoxiciteitstest. Een onderzoek van de A + B – stam uit de derde episode onthulde een volledige afwezigheid van het tcdb-gen of andere genen die nodig zijn voor de productie van toxines en een deletie in het tcda-gen.Bovendien kon de A + B – variant in vitro geen toxine A of toxine B produceren, waardoor de relevantie ervan als oorzaak van de symptomen van de patiënt in twijfel werd getrokken.

het vermogen om genetisch C-diff te ontwikkelen dat alleen toxine A (A+B – mutanten) of toxine B (A-B+ mutanten) produceert en gevoelige hamsters met de mutanten infecteert, heeft geleid tot twee onderzoeken naar het individuele belang van deze toxinen in het ziekteproces. In een studie concludeerden de auteurs dat toxine B essentieel is voor de ziekte, terwijl toxine A niet nodig is.10 uit het tweede onderzoek bleek dat beide toxines ziekte konden veroorzaken, maar dat alleen de mutantstammen die toxine B produceren, een ernstigere ziekte veroorzaakten.Hoewel de twee studies elkaar lijken tegen te spreken, zijn de bevindingen van Lyras et al, meer consistent met wat tot nu toe in de klinische praktijk is waargenomen, in die zin dat alle klinisch relevante C-diff-stammen (inclusief a+B+ en A-B+ varianten) toxine B produceren en de afwezigheid van van nature voorkomende ziekteveroorzakende stammen die alleen toxine A produceren.

laboratoriumtesten voor de detectie van toxigene C diff ter bevestiging van een CDI diagnose bij patiënten blijven een uitdaging vanwege de prestaties van veelgebruikte toxine A/B EIAs of een doorlooptijd voor gevoeligere methoden zoals toxigene cultuur.Snelle moleculaire testen voor toxigene C diff heeft de nauwkeurigheid waarmee CDI patiënten kunnen worden gediagnosticeerd en behandeld aanzienlijk verbeterd. Met betrouwbare gevoeligheden en specifieke kenmerken voor toxigene cultuur, kunnen artsen vertrouwen laboratoriumresultaten die hun klinische vermoeden van CDI bevestigen of uit te sluiten C diff als de bron van de symptomen van een patiënt. Volgens de nieuwe SHEA/IDSA (Society for Healthcare Epidemiology of America and Infectious Diseases Society of America) clinical practice guidelines voor CDI bij volwassenen, lijken PCR-tests snel, gevoelig en specifiek te zijn en kunnen ze uiteindelijk de testproblemen aanpakken.12

alle FDA-geklaarde real-time polymerasekettingreactie-of PCR-tests zijn gericht op het toxine B-gen (tcdb). De keuze voor tcdb als moleculair doelwit is om verschillende redenen ideaal: de essentiële rol van toxine B in het ziekteproces10,11; de aanwezigheid van toxine B en tcdb in alle ziekteproducerende stammen; en bewijs dat detectie van tcdb bij symptomatische patiënten goed correleert met een nauwkeurige diagnose van CDI.13

de motivering voor andere doelwitten zoals het tcda-gen is minder duidelijk. Veel A-B+ variant C diff stammen hebben verwijderingen in de toxine A gene14 en zijn mogelijk niet betrouwbaar als doelwit. In tegenstelling tot het tcdb-gen ontbreken studies die aantonen dat de detectie van tcdA correleert met klinische ziekte; en omdat het gen ook alleen kan worden gevonden in niet-ziekteveroorzakende stammen, kan de detectie van tcdA mogelijk leiden tot een verkeerde diagnose van CDI.

CDI diagnose vereist een combinatie van klinische symptomen en nauwkeurige detectie van toxigene C diff in de ontlasting van een symptomatische patiënt.Bij passend gebruik en beperkt tot patiënten met symptomen die overeenkomen met een klinische ziekte, kunnen PCR-tests die gericht zijn op het tcdb-gen een nauwkeurige diagnose van CDI vergemakkelijken, wat op zijn beurt kan leiden tot een betere behandeling van de patiënt met geschikte therapie en onmiddellijke implementatie van infectiebeheersingsmaatregelen.

Diane Kawa, PhD, SM (ASCP),
is directeur wetenschappelijke zaken bij BD in Franklin Lakes, NJ.