negatieve frequentieafhankelijke selectie draagt bij tot het behoud van een globaal polymorfisme in mitochondriaal DNA

constructie van Mito-nucleaire introgressielijnen

om de genetische effecten van mtDNA uit het nucleaire genoom te isoleren, werden onze experimenten gebaseerd op mitonucleaire introgressielijnen (mnils). De bouw van onze MNILs wordt in detail uitgelegd in Kurbalija Novicic et al. . In het kort werden alle gebruikte MNILs gemaakt op basis van isofemale lijnen (IFL’s), die elk werden opgericht door een enkel in het wild verzameld vrouwtje afkomstig van een gemeenschappelijke natuurlijke populatie (Sicevo kloof-Servië, S 43°19 ‘55.58″ N 22°0837.98″). Lijnen werden eerst gegenotypeerd voor hun mtDNA haplotype met behulp van restrictie-enzymen en we selecteerden zes IFL ‘ s, waarvan er drie HI haplotypes droegen en drie hii haplotypes, die elk vervolgens werden gekruist met een gemeenschappelijke zevende IFL (“D”). In elke MNIL werd backcross uitgevoerd door 10 maagdelijke vrouwtjes van een gegeven IFL te koppelen met 20 mannetjes van de D-lijn. We gebruikten deze herhaalde introgressieve backcross procedure voor 12 volgende generaties om het nucleaire genoom van een gegeven IFL te vervangen door het gemeenschappelijke outbred d nucleaire genoom (> 99,95% vervangen). Merk op dat IFL ‘ s niet inteelt of anderszins gemaakt isogeen. Om de mogelijkheid van contaminatie tijdens introgressie uit te sluiten, werd de mtDNA-integriteit van alle MNILs gevalideerd bij generatie 5, 8 en 12 door een monster van vliegen van elk MNIL te genotyperen. We hebben ook gescreend op de aanwezigheid van Wolbachia in alle MNILs, door een PCR-test met behulp van 16S rDNA Wolbachia-specifieke primers met behulp van methoden gedetailleerd in García-Martínez et al. . We gebruikten twee verschillende Drosophila soorten die Wolbachia bevatten als positieve controles (D. melanogaster stock no. 5, Bloomington Stock Centre, D. simulans, Riverside strain). Deze PCR-tests waren negatief voor al onze MNILs en voor de D-lijn. Alle lijnen werden gehandhaafd en alle experimenten werden uitgevoerd onder constante laboratoriumomstandigheden, bij 19 °C, 60% Relatieve vochtigheid, licht van 300 lux, en bij een fotoperiode van 12 uur licht: 12 uur donker.

oprichting van de experimentele evolutiepopulaties

voorafgaand aan de experimenten hebben we de drie MNILs die HI bevatten samengevoegd tot één HI-bronpopulatie en de drie HII-MNILs tot een hii-bronpopulatie om potentiële nucleaire genetische variatie tussen MNILs te homogeniseren. Dit werd gedaan door 100 volwassen vliegen van elk MNIL te mengen, in twee kooien (d.w.z., N = 3 × 100 vliegen per kooi) (plexiglas kooien, L25 cm x B15 cm xH15 cm, met 3 gerechten die elk 30 ml maïsmeel bevatten) en deze gedurende een volgende volledige generatie onder standaard laboratoriumomstandigheden te handhaven. De twee bronpopulaties, dus, droegen ofwel de HI of de hii mtDNA haplotype, uitgedrukt in een outbred en gemeenschappelijke nucleaire genetische achtergrond (dwz, D). Maagdelijke vliegen uit deze twee bronpopulaties werden toen geseksed en gebruikt om de experimentele evolutiepopulaties te vinden.

we begonnen met n = 12 experimentele evolutiepopulaties. In elke populatie werden n = 100 maagdelijke vliegen (geslachtsverhouding 1:1) van 3-5 dagen van de bronpopulaties in een populatiekooi geïntroduceerd (L25 cm x B15 cm xH15 cm). We varieerden de startfrequentie van HI en HII haplotypes en voedselbronnen over populaties, met behulp van een 2 × 2 gekruist ontwerp (N = 3 populaties per cel), op de volgende manier. In de helft van de kooien was 80% van de stichtende vliegen afkomstig van de HI-bronpopulatie en 20% van de HII-bronpopulatie. In de andere helft waren 20% van de stichtende vliegen afkomstig van de HI-bronpopulatie en 80% van de HII-bronpopulatie. In termen van voedselhulpbronnen was de hoeveelheid medium (zowel naar volume als oppervlakte) identiek in de twee behandelingsgroepen, terwijl binnen de populatie variatie in nutriëntenconcentratie als volgt werd gemanipuleerd. De helft van de kooien (homogenous food conditions) bevatte 3 identieke voedselschalen, elk met 30 ml Standaard maïsmeelmedium (YC) met 1,5% gist. De andere helft van de kooien (heterogene voedselomstandigheden) bevatte ook 3 gerechten met elk 30 ml standaardmedium, maar deze verschilden in gistconcentratie (YL-0,375%, YC – 1,5%, YH – 6%).

instandhouding van de experimentele evolutiepopulaties

populaties werden in het laboratorium gehouden op een manier die zorgde voor discrete generaties, 40 dagen/cyclus , bij 19 °C, 60% Relatieve vochtigheid en een 12 uur licht: 12 uur donker cyclus. Op dag 40 werden de drie oude gerechten vervangen door drie nieuwe en mochten vliegen in totaal 9 dagen voor ovipositie. De nieuwe schotels, met eieren en larven, werden vervolgens verwijderd van alle volwassenen en overgebracht naar een nieuwe kooi om de volgende generatie te starten. Alle volwassen vliegen in elke oude kooi werden toen geteld, zodra ze dood waren.

Sequencing-en mitogenoomassemblages

voorafgaand aan de haplotypefrequentieschatting (zie hieronder) hebben we alle gebruikte mtDNA haplotypes gesequenced en geassembleerd. DNA werd uit de zes lijnen van IF gehaald (HI: 1, 3, 5; HII: 21, 25, 29) die worden gebruikt om MNILs tot stand te brengen, gebruikend een zout-ethanolprecipitatie protocol. Vliegen werden eerst voorzichtig gemacereerd en in voorbereidingsbuffer geplaatst (100 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, pH = 8,0, 0,5% SDS) samen met proteïnase K, vortexed en ‘ s nachts geïncubeerd bij 50 °C. De monsters werden ‘ s nachts ingevroren. Om DNA te precipiteren, voegden we verzadigde NaCl meerdere malen toe voordat we 95% ethanol toevoegden, en we sponnen het DNA in een pellet. De DNA-pellet werd gesuspendeerd in te 4-buffer (pH = 7,6). De kwaliteit en kwantiteit van DNA werden beoordeeld gebruikend NanoDrop, Qubit en Bioanalyzer, gevolgd door de beoordeling van de fragmentlengte op een agarosegel.

Sequentiebibliotheken werden bereid uit 100 ng DNA met behulp van de TruSeq PCRFREE DNA library preparation kit. De zes steekproeven werden toen gerangschikt aan 125 BP in paren gerangschikt-eindlezen in twee stegen op een Illumina HiSeq2500 systeem gebruikend v4 het rangschikken chemie. In totaal hebben we per bibliotheek gemiddeld 194 miljoen keer gelezen. Mitogenomes van de zes steekproeven werden toen geassembleerd gebruikend een 5% subset van het totale aantal leest van elke bibliotheek. Reads werden ingevoerd om de MITObim v 1.8 algoritme en de MIRA v 4.0.2 assembler, om geleide assemblages uit te voeren, gebruikend de Drosophila pseudoobscura mitogenome (GenBank: FJ899745.1) als referentiegenoom. Alle verkregen assemblages waren cirkelvormige mitogenomen met een grootte van bijna 16kbp. De uiteindelijke assemblages werden vervolgens uitgelijnd met behulp van ClustalW en MAFFT, en handmatig samengesteld om een uiteindelijke gepolijste assemblage te verkrijgen voor elk haplotype. De geassembleerde mitogenomes werden geannoteerd gebruikend DOGMA en MITOS, gebruikend standaardparameterinstellingen, en tenslotte handmatig samengesteld.

om de validiteit van onze mitogenoomassemblage te beoordelen, werden alle Drosophila subobscura mtDNA-sequenties beschikbaar op GenBank (Cox1, Cox2, Cox3, Cob, Nad1, Nad2, Nad3, Nad5, rrnL, rrnS, de A + T rijke regio, en verscheidene trna), die in totaal meer dan 50% van de totale assemblage besloegen, afgestemd op onze mitogenomen. Zonder uitzondering vertoonden deze > 99% sequentieidentiteit.

verschillende unieke SNP ‘ s werden gevonden in elk van de zes mitogenome haplotype (zie hieronder), waarvan er twee consequent onderscheid maakten tussen de HI en HII haplotype groepen. De dekking diepte voor elke SNP werd geverifieerd door het in kaart brengen van de reads gebruikt voor de mitogenome vergadering met behulp van Bowtie v 1.2 . Deze inspanningen bevestigden alle SNP ‘ s die in de assemblagestap werden geïdentificeerd. Hier richten we ons op de twee belangrijkste haplotypegroepen I en II, die een opvallend en consistent patroon van binnen-populatie polymorfisme over populaties laten zien (Fig. 1) en functionele fenotypische verschillen (zie Inleiding). Hoewel SNP ’s wel voorkomen binnen elk van de twee haplotypegroepen, zijn dergelijke SNP’ s zeldzaam (B.V.) en zijn ze niet consistent polymorf.

schatting van de mtDNA haplotypefrequenties

we gebruikten pool-seq om de evolutie van de haplotypefrequentie te schatten, door monsters van vliegen van de 5e en 10e generatie van elke experimentele evolutiepopulatie te sequencen. In elk monster werden 105 willekeurig geselecteerde vliegen per kooi samengevoegd en onderworpen aan DNA-extractie (in groepen van 15) en sequencing bibliotheekvoorbereidingen zoals hierboven beschreven. De N = 24 steekproeven werden toen gerangschikt aan 125 BP in paren gerangschikt-eindlezen in twee stegen op een Illumina hiseq2500 systeem, gebruikend v4 die chemie rangschikken. Onze pool-seq inspanning werd ontworpen om voldoende het rangschikken diepte voor nauwkeurige schatting van mtDNA haplotypy frequenties te verstrekken, maar staat geen gedetailleerde analyses van het nucleaire genoom toe.

we sequentieerden gemiddeld 66 miljoen reads voor elke bibliotheek. Reads uit elke bibliotheek werden vervolgens in kaart gebracht terug naar de zes geassembleerde mitogenomen, met behoud van alleen unieke en nul-mismatch mappings met behulp van Bowtie v 1.2 . Het aantal reads mapping naar de twee SNP ‘ s die de HI en HII types onderscheidden (in Nad5 en in 12S rRNA) werden vervolgens geteld en gebruikt als onze schatting van de relatieve frequentie van elk hoofd haplotype (HI of HII) in elk monster.

statistische analyses

voor elk monster werden alle meetwaarden voor de twee diagnostische SNP ‘ s (zie hieronder) geteld als zijnde van type HI of type HII. Het aandeel HI reads voor de twee verschillende SNP ‘ s was inderdaad zeer nauw gecorreleerd over de 24 monsters (r = 0,987), zodat beide markers vrijwel identieke schattingen opleverden. Hier, gebruikten we de gemiddelde verhouding over beide SNPs hier om de frequentie van HI huidig in elke pool-seq steekproef te schatten.

evolutie kan worden gedefinieerd als veranderingen in genotype frequenties binnen een populatie, en onze ontwerp stelde ons in staat om twee temporeel gescheiden herhaalde maten af te leiden van haplotypefrequentieveranderingen per generatie in onze elke evoluerende lijn als ofwel Δf0–5 = (f5 – f0)/5 of Δf5–10 = (f10 – f5)/5 waar subscripten de generatie aangeven waarbij het monster werd verzameld. Daarnaast hebben we Δf0–10 = (f10 – f0)/10 geschat om de verandering van de haplotypefrequentie te beoordelen. Omdat er slechts twee genotypes bij betrokken waren, de frequentie van HI: fI = 1 – fII, en we onze analyses dus beperken tot veranderingen in de frequentie van een van de haplotypes. Voor elke schatting van Δf hebben we ook een frequentieafhankelijke selectiecoëfficiënt (SI) afgeleid die overeenkomt met de sterkte van de selectie die nodig is om de waargenomen verandering in haplotypefrequenties te veroorzaken (zie hieronder).

elke evoluerende lijn vertegenwoordigt een observationele eenheid in ons ontwerp, en daarom analyseerden we onze gegevens met behulp van herhaalde metingen Anova ’s (d.w.z., binnen-proefpersonen Anova’ s). Hier vertegenwoordigt elke lijn het onderwerp, en beginfrequentie van HI (0,2 of 0,8) en omgevingsconditie (homogeen of heterogeen) waren twee tussen-proefpersonen factoren, en de twee herhaalde metingen (van Δf of SI) genomen met verschillende generatieintervallen werden behandeld als een binnen-proefpersonen factor. In deze analyses testen de focal between-subject factors de effecten van onze experimentele behandelingen en de interin-subject factor of het evolutiepatroon veranderde in de loop van ons experiment. Deze analytische strategie is gebaseerd op het feit dat we frequentiedynamica in gerepliceerde en onafhankelijke lijnen volgen en het niet-focale effect van willekeurige genetische drift, waarvan wordt voorspeld dat het substantieel is voor mtDNA dynamica, maakt deel uit van de resterende termijn van onze inferentiële modellen. Conventionele F-tests van de factoren tussen proefpersonen werden gevalideerd met behulp van permutatietests, gebaseerd op 9999 willekeurige permutaties van gegevens. Gemiddelde SI voor verschillende groepen werden beoordeeld met behulp van 95% BI ‘ s van 9999 bootstrap replicaties van gegevens.

schattingen van de sterkte van frequentieafhankelijke selectie

we wilden ook meer expliciet beoordelen of de sterkte van frequentieafhankelijke selectie van HI en HII verschilde tussen de twee experimentele milieubehandelingen (homogeen / heterogeen). Om dit mogelijk te maken, we afgeleid eenvoudige maten van frequentie afhankelijke selectie van onze empirische gegevens met behulp van de volgende redenering. Eerdere expliciete modellering van niet-experimentele gegevens in dit systeem heeft aangetoond dat de meest geschikte dynamische gegevens met haplotypefrequentie optreden wanneer er geen positieve of negatieve selectie is op deze mtDNA haplotypes, maar waar er een negatieve frequentieafhankelijke selectie is die even sterk is op beide haplotypes . We beschouwen de twee mtDNA haplotypes HI en HII, met de frequenties pI en pII (pI + pII = 1) en fitnesses WI en WII. De verandering per generatie in pI wordt dan gegeven door

waarnemingen van beide natuurlijke populaties (zie Fig. 1; aanvullend dossier 1) en gerepliceerde laboratoriumkooi populaties suggereren ook dat selectie symmetrisch is met een evenwicht voor de twee haplotypes HI en HII in de buurt van pI = pII = 0,5. Uitgaande van (i) een evenwichtsfrequentie van pI = pII = 0.5, (ii) dat haplotype fitness lineair gerelateerd is aan haplotype frequentie en (iii) dat selectie symmetrisch is, die allemaal worden ondersteund door eerdere studies, bereiken we

waarin sI de frequentieafhankelijke selectiecoëfficiënt is. Gezien het feit dat \( \overline{W}={p}_I{W}_I+{p}_{II}{W}_{II} \) we kunnen dan een schatting van sI van onze empirische waarnemingen van ΔpI als

bepaald deze manier, sI uitgegaan van een willekeurige schaal, maar is positief wanneer van ΔpI veranderingen in de richting van de attractor en negatief wanneer het verandert afstand van de attractor. Voor elke kooi schatten we twee onafhankelijke herhaalde metingen van sI op basis van de waargenomen haplotypefrequentieveranderingen tussen generaties 0-5 en 5-10, respectievelijk. We merken op dat onze maat precies zal zijn als het ware evenwicht dichtbij pI = pII = 0,5 is, maar meer bij benadering als het ware evenwicht van deze voorwaarde afwijkt.