ABSTRACT
influenzavirus neuraminidase (NA) speelt een essentiële rol bij de afgifte en verspreiding van nieuwe virionen na de intracellulaire virale replicatiecyclus. Om te testen of NA ook het binnendringen van virussen in de cel kon vergemakkelijken, hebben we culturen van humaan luchtwegepitheel geïnfecteerd met humane en aviaire influenzavirussen in aanwezigheid van de na-remmer oseltamivircarboxylaat. Zeven uur na het aanbrengen van het virus raakten twintig tot 500 maal minder cellen geïnfecteerd in met het geneesmiddel behandelde versus niet – behandelde culturen (p < 0,0001), wat erop wijst dat het geneesmiddel het begin van de infectie onderdrukte. Deze gegevens tonen aan dat virale NA een rol speelt in een vroeg stadium van de infectie, en zij bieden verdere motivering voor het profylactisch gebruik van na-remmers.
er wordt aangenomen dat de belangrijkste functie van virale neuraminidase (NA) zich bevindt in het laatste stadium van de infectie, wanneer NA siaalzuur van het celoppervlak en nieuwe virionen splijt die de virusuitgifte uit geïnfecteerde cellen vergemakkelijken (1, 2). Minder is bekend over na-functies tijdens virusingang in de cel. Lang is aangenomen dat NA de virustoegang tot doelcellen in de luchtwegen bevordert door slijmdegradatie (3). Dit concept is echter nooit formeel bewezen door het ontbreken van een adequaat experimenteel systeem. Bovendien is enig bewijs tegen de rol van NA in de vroege stadia van infectie gerapporteerd (zie referentie 2).
om dit probleem aan te pakken, bestudeerden we de effecten van de na-remmer oseltamivircarboxylaat (OC) (9) op het binnendringen van het influenzavirus in culturen van humaan luchtwegepitheel. Primaire humane tracheobronchiale epitheliale cellen (HTBE; Clonetica) en primaire nasale epitheliale cellen (PromoCell GmbH) werden gekweekt op membraansteunen (12-mm Transwell-Clear; Corning, Inc.) op het raakvlak tussen lucht en vloeistof in serumvrije groeifactor en met hormonen aangevuld medium (6, 8). Voor alle experimenten werden volledig gedifferentieerde 4-tot 8-weken oude culturen gebruikt. Deze culturen waren gepseudostratiseerd en gepolariseerd; bevatten basale, ciliated en slijm-afscheidende cellen; en zeer veel leek op menselijk luchtwegepitheel in vivo (Fig. 1). OC (1 µM, indien niet anders aangegeven) werd toegevoegd aan virussuspensies en aan basolaterale compartimenten van de culturen kort voordat twee replicaatculturen vanaf de apicale zijde werden besmet. Twee controleculturen werden geïnfecteerd zonder remmer. Een uur na de infectie verwijderden we het virus entmateriaal en incubeerde culturen aan de lucht-vloeistof interface voor extra 6 uur om intracellulaire virusreplicatie mogelijk te maken. De culturen werden toen gefixeerd, en de besmette cellen werden geà dentificeerd door het bevlekken met polyclonal antisera aan gehele virussen gevolgd door overeenkomstige peroxidase-geëtiketteerde secundaire antilichamen (Dianova) en aminoethylcarbazole substraat (Sigma). Positieve kleuring wees op succesvolle virusinvoer in de cel. De culturen werden geanalyseerd en face met een vergroting van × 300 (Olympus IMT-2). Een totaal aantal cellen dat viraal antigeen uitdrukt werd geteld in het epitheliale segment dat alle opeenvolgende microscopische weergaven omvatte (0,28 bij 0,42 mm) langs de diameter van de cultuur (segmentoppervlak, 3 mm2; aantal cellen per segment, ongeveer 30.000). Vier segmenten per cultuur werden geteld door de cultuur met de klok mee te roteren met 45o. de gegevens voor acht segmenten van twee gerepliceerde culturen werden gemiddeld.
In twee experimenten met htbe-culturen heeft het humane virus A/Memphis/14/96 (H1N1) 22 en 65 maal minder cellen geïnfecteerd in aanwezigheid van een NA – remmer dan in de controlegroep (Fig. 2; Tabel 1) (P < 0,0001). Virussen A/Duck/Alberta/119/98 (H1N1) van een wilde watervogel en A/Turkey/Italy/2379 / 99 (H7N1) van gedomesticeerd pluimvee waren ook duidelijk gevoelig voor OC in deze culturen. In nasale epitheliale culturen verminderde OC de infectie met het humaan en het eendvirus respectievelijk met een factor 120 en 520. Deze resultaten toonden aan dat remming van virale NA de initiatie van virusinfectie onderdrukt.
A/Chicken/Germany/R28 / 03 (H7N7) behoort tot de hoogpathogene lijn van het aviaire-influenzavirus die in 2003 in commerciële pluimveehouderijen in Nederland, België en Duitsland een uitbraak van de vogelpest heeft veroorzaakt. Deze virussen werden overgedragen op ten minste 89 mensen, van wie de meesten met conjunctivitis, maar een fataal geval van pneumonie deed zich ook voor (5). De h7n7 kippenvirus infectie in HTBE culturen was verlaagd 140-en 40-voudig in aanwezigheid van 1 en 0,1 µM OC, respectievelijk. Deze concentraties vertegenwoordigden typische plasma maximale en minimale concentraties van het geneesmiddel die bij mensen werden bereikt na toediening van 75 mg oseltamivirfosfaat, de aanbevolen dosis voor profylaxe (9).
om de hypothese te bevestigen dat de inhibitie van infecties in onze experimenten direct gerelateerd was aan de inhibitie van virale na enzymatische activiteit, gebruikten we humaan A / Sydney/5/97-zoals virus (H3N2) en zijn oseltamivir-resistente mutant met een r292k-substitutie in de NA, waardoor de NA 9.000 maal minder gevoelig is voor remming door OC (4). In overeenstemming met de hypothese werd het oorspronkelijke humane virus sterk geremd door OC, terwijl slechts een marginale mate van remming van de resistente mutant werd waargenomen wanneer beide virussen in hetzelfde experiment in HTBE-culturen werden getest (Tabel 1). Tot nu toe was er geen adequate celcultuurtest beschikbaar voor het monitoren van de resistentie van het influenzavirus tegen na-remmers vanwege de mismatch tussen siaalzuurreceptoren bij mensen en in conventionele laboratoriumcellijnen (9, 11). Onze resultaten suggereren dat gedifferentieerde culturen van menselijk luchtwegepitheel een geschikt celcultuursysteem kunnen zijn voor detectie van influenza virus resistentie tegen na remmers.
ten slotte werd het gebruik van de drug-sensitive a / Sydney/5/97-net als virus, hebben we infectieremming getest door OC toegevoegd op verschillende tijdstippen na virusinoculatie. Terwijl 47-voudige minder cellen werden geïnfecteerd toen het geneesmiddel kort voor de infectie werd toegevoegd, resulteerde een 1-uur vertraging naast OC in slechts 1,5-voudige remming ten opzichte van de niet-behandelde controle (Tabel 1). Als het geneesmiddel 4 uur na virusinoculatie werd toegevoegd, werd geen statistisch significante remming waargenomen. Deze gegevens suggereerden dat OC de vroegste stadia van infectie voorafgaand aan virusreplicatie beïnvloedde.Samenvattend hebben wij hier voor het eerst rechtstreeks experimenteel bewijs geleverd voor de essentiële rol van NA in het stadium van virusinvasie van het gepiliateerde epitheel van de menselijke luchtwegen. De functie NA in dit stadium is hoogstwaarschijnlijk verwijdering van lokreceptoren op mucins, trilharen, en cellulaire glycocalix, sterke band aan elk waarvan virustoegang tot functionele receptoren op oppervlaktemembraan van doelcellen zou belemmeren. Andere NA—functies-bijvoorbeeld de bevordering van hemagglutinine—gemedieerde fusie (7) – kunnen echter niet worden uitgesloten, en verdere studies zijn nodig om de exacte mechanismen te specificeren waardoor NA virusingang in epitheliale cellen in de luchtwegen bevordert.
aangezien er nog geen vaccin beschikbaar is tegen hoogpathogene aviaire-influenzavirussen van h7n7 en H5N1, blijven antivirale geneesmiddelen de enige optie om vogelgriep te bestrijden (10). In vergelijking met andere anti-influenza middelen worden de na remmers goed verdragen en effectief tegen alle stammen van influenza A en B virussen. Er zijn weinig aanwijzingen voor het ontstaan van virale resistentie en de infectiviteit van gemuteerde virussen is gewoonlijk in gevaar (9, 11). Het vermogen van na-remmers om infecties te onderdrukken voordat het virus in cellen wordt binnengebracht, onderstreept hun hoge potentieel voor preventieve maatregelen. In het bijzonder bieden onze gegevens De wetenschappelijke basis voor het profylactisch gebruik van deze stoffen voor personen met een hoog risico op besmetting met aviaire influenzavirussen.
