Noordelijke bevlekken

Korte Inleiding: Blotting technieken

Blotting wordt gebruikt in de moleculaire biologie voor de identificatie van eiwitten en nucleïnezuren en wordt veel gebruikt voor diagnostische doeleinden. Deze techniek immobiliseert de molecule van belang op een steun, die een nitrocellulosic membraan of nylon is. Het gebruikt hybridisatietechnieken voor de identificatie van de specifieke nucleic zuren en genen.

de blottechniek is een hulpmiddel dat wordt gebruikt bij de identificatie van biomoleculen zoals ad-DNA, mRNA en eiwit tijdens verschillende stadia van genexpressie. De eiwitsynthese impliceert uitdrukking van een segment van DNA dat in mRNA wordt omgezet om de respectieve proteã ne te produceren.

Subtypes van blotting zoals noordelijk, westelijk & zuidelijk hangen af van het doelmolecuul dat wordt gezocht. Wanneer een opeenvolging van DNA de stichting of de code voor een eiwitmolecuul is, kan de specifieke molecuul van DNA van belang worden uitgewist gebruikend Zuidelijke het bevlekken techniek. Tijdens genuitdrukking, wanneer DNA als mRNA voor een eiwitproductie wordt uitgedrukt, kan dit proces door het noordelijke bevlekken worden geà dentificeerd. Tenslotte, produceert gecodeerde mRNA de betrokken proteã ne, kan deze eiwitidentificatie door Western Blotting worden gedaan.

algemene procedure voor het bevlekken

1. Homogeniseer het monster.
2. scheiding van het betrokken molecuul door een elektroforesemembraan.
3. het overbrengen van de moleculen naar een nitro cellulosemembraan/ nylon membraan.
4. hybridisatie of identificatie van het molecuul

Northern Blotting

Northern Blotting is een techniek die wordt gebruikt voor de studie van genexpressie. Het wordt gedaan door opsporing van bepaald RNA (of geà soleerde mRNA). mRNA wordt over het algemeen vertegenwoordigd als 5% van de totale opeenvolging van RNA. Deze methode onthult de identiteit, het aantal, de activiteit, en de grootte van het specifieke gen. Deze het bevlekken techniek kan ook voor de groei van een weefsel of organisme worden gebruikt. In verschillende stadia van differentiatie en morfogenesis verandert de overvloed van RNA en dit kan gebruikend deze techniek worden geà dentificeerd. Het helpt ook bij de identificatie van abnormale, zieke of geïnfecteerde aandoening op moleculair niveau. De northern blot techniek werd ontwikkeld in 1977 door James Alwine, David Kemp en George Stank aan de Stanford University. De techniek kreeg zijn naam toe te schrijven aan de gelijkenis van het proces met zuidelijk bevlekken. Het primaire verschil tussen deze twee technieken is dat het noordelijke bevlekken slechts over RNA betreft.

Principe

zoals alle normale bevlektechnieken, begint het noordelijke bevlekken met de elektroforese om RNA-monsters naar grootte te scheiden. De elektroforese scheidt de molecules van RNA die op de last van de nucleic zuren worden gebaseerd. De lading in de nucleïnezuren is evenredig met de grootte van de nucleïnezuursequentie. Aldus scheidt het elektroforesembraan de Nucleic zure opeenvolging volgens de grootte van de opeenvolging van RNA. In gevallen waar onze doelopeenvolging een mRNA is, kan de steekproef door oligo-cellulose chromatografische technieken worden geà soleerd, aangezien mRNA door poly(a) – staart worden gekenmerkt. Aangezien gelmoleculen fragiel van aard zijn, worden de gescheiden opeenvolgingen overgebracht naar de nylon membranen. De selectie van nylon membraan wordt bijgedragen aan de factor die nucleic zuren negatief in Aard worden geladen. Zodra de molecules van RNA worden overgebracht wordt het geïmmobiliseerd door covalente verbinding. De sonde wordt dan toegevoegd, kan de sonde een opeenvolging van ss DNA complementair zijn. Formamide wordt over het algemeen gebruikt als het bevlekken buffer aangezien het de onthardende temperatuur vermindert.

Procedure

1. het verzamelde weefsel-of kweekmonster wordt eerst gehomogeniseerd. De steekproeven kunnen van verschillende soorten cultuur voor vergelijking representatief zijn of het kan voor de studie van verschillende stadia van groei binnen de cultuur zijn.
2. de RNA-sequentie wordt gescheiden in de elektroforese-eenheid een agarose-gel wordt gebruikt voor de nucleïnezuurscheiding.
3. nu wordt de gescheiden RNA-sequentie overgebracht naar het nylon membraan. Dit wordt gedaan door twee mechanismen capillaire actie en de Ionische interactie.
4. de overdracht wordt uitgevoerd door de gel in de volgende volgorde te houden. Eerst wordt de agarose gel op de bodem van de stapel geplaatst, gevolgd door het blotting membraan. Bovenop deze papieren handdoeken is een mild gewicht (glasplaat) geplaatst. De hele setup wordt bewaard in een bekerglas met transferbuffer.
5. RNA overgebracht naar het nylon membraan wordt dan gefixeerd met behulp van UV-straling.
6. het vaste nylon membraan wordt vervolgens gemengd met sondes. De sondes worden specifiek ontworpen voor het gen van belang, zodat zij met de opeenvolgingen van RNA op de vlek zullen kruisen die aan de opeenvolging van belang overeenstemmen.
7. het vlekmembraan wordt gewassen om ongewenste sonde
8. te verwijderen gelabelde sonde wordt gedetecteerd door chemiluminescentie of autoradiografie. Het resultaat zijn donkere banden in röntgenfilm.

GEl en Probes

de RNA-monsters worden gescheiden met agarose-gels waarbij formaldehyde als denatureringsmiddel wordt gebruikt, maar in kleine RNA-of micro-RNA-sequenties kunnen ook polyacrylamidesequenties met ureum als denatureringsmiddel worden gebruikt. Ethidiumbromide kan als kleurstof worden gebruikt. Twee soorten markers zijn voor grootte markering. Een ladder van RNA en ribosomal subeenheid worden gebruikt voor de identificatie van de grootte van de opeenvolgingen van RNA.

Probes kunnen complementair zijn aan het gehele of een deel van het RNA van belang. Zij kunnen RNA, DNA of oligonucleotides van 25 complementaire basisparen aan doelrna zijn. In het geval van RNA-sondes, invitro geproduceerde sondes worden gebruikt als invivo sondes kunnen denatureren als gevolg van de strenge wassen. In het geval van cDNA, worden de sondes geëtiketteerd met radioactieve isotopen, alkalische fosfatase of mierikswortelperoxidase in het geval van chemiluminescentie.