oncologische rapporten

Inleiding

hoewel onlangs nieuwe therapieën zijn geïntroduceerd in de klinische praktijk voor de behandeling van geavanceerde prostaat kanker, is prostaatkanker in 2014 de tweede dodelijkste kanker bij mannen in de Verenigde Staten gebleven (1). Er zijn dringend nieuwe therapeutische doelstellingen en strategieën nodig om de klinische resultaten van patiënten met prostaatkanker verder te verbeteren.

één veelbelovend potentieel therapeutisch doel iscycline-afhankelijk kinase 5 (CDK5). CDK5 is een serine / threonine kinasestructurally vergelijkbaar met andere CDK ‘ s (2). CDK5 lijkt geen belangrijke rol te hebben in de regulatie van de celcyclus (3,4). Het is goed gekarakteriseerd door zijn dominerende rol in de ontwikkeling van het centrale zenuwstelsel, waaronder rollen in euronale migratie, differentiatie en adhesie (5,6). Wij en anderen toonden vervolgens aan dat CDK5 een belangrijke rol speelt bij kankerontwikkeling en metastase (7-12). In prostate kankercellen, toonden we aan dat CDK5 kritisch was voorcytoskeletal integriteit, celmigratie en invasie, en invivo, voor metastase (7). Bij kanker van het kankergezwel is CDK5 intrinsiek aan kras-signalering via de Centraal belangrijke RAL-signaaltransductieweg, waardoor een potentiële ‘druggable’ target voor gemuteerde kras-tumoren ontstaat (8). Samen geven deze studies aan dat een verbod op CDK5, alleen of in combinatie met andere middelen, een effectieve therapeutische strategie kan bieden voor deze en andere kankertypes.

in deze studie hebben we getracht agenten te identificeren die bijzonder effectief zouden zijn in combinatie met Cdk5-remming in prostaatkankercellen. Daarom hebben we ascreen uitgevoerd van de Johns Hopkins Drug Library (JHDL). JHDL is een verzameling van 3.360 farmaceutische samenstellingen die met succes veiligheidstesten in mensen voor een verscheidenheid van toepassingen hebben voltooid (13,14). Deze bibliotheek is met succes gebruikt voor het repurposing van samenstellingen voor kankertherapie,met inbegrip van identificatie van digoxine als hif1a-inhibitor (15), en itraconazole als angiogenesisinhibitor (16). We hebben eerder jhdl ingezet om cetrimoniumbromide en irinotecan te identificeren als compounds met verhoogde antitumoractiviteit tegen prostaatkankercellen die lage niveaus van het metastasesonderdrukkende gen n-mycdownregulated Gen 1 (NDRG1) uitdrukken (17).Hier hebben we een soortgelijke jhdl-screening uitgevoerd met prostaatkankercellen die verschillen in CDK5-activiteit. Tiloron werd geïdentificeerd als een bestanddeel met in vitro synthetische letaliteit inCDK5-deficiënte prostaatkankercellen.

materialen en methoden

celcultuur

PC3 prostaatkankercellijnen werden verkregen uit ATCC. Deze cellen zijn afgeleid van een botmetastase van een 62-jarige prostaatkanker patiënt. Menselijke prostaatfibroblasten, die door Dr. J. Isaacs worden verstrekt, werden verkregen uit een prostaatbiopsie bij een 62-jarige prostaatkankerpatiënt met een Gleason score van 4. Bothcell lijnen werden gekweekt en gehandhaafd in rpmi-1640 (Invitrogen)media aangevuld met 10% foetaal runderserum. Cellen werden gekweekt in een bevochtigde incubator bij 37°C in een 5% Co2atmosfeer.

creatie van de PC3 CDK5dn-cellijn

verlies van de CDK5-functie werd bereikt in PC3-cellen door transfectie van een dominant-negatieve constructie die een D144nmutatie bevatte, vriendelijk verstrekt door Dr.L. H. Tsai (Harvard Medical School)(18). Het gebruikte protocol is eerder beschreven (7). Kortom, de constructie werd gesubcloneerd in een bidirectionele Tet vector, pBI-EGFP(Bd Biosciences), die een zeocin resistentie gen toegevoegd voor selectie (vriendelijk verstrekt door Dr K. Schuebel, Johns HopkinsUniversity School Of Medicine). PBI-EGFP lege vector of PBI-EGFPCDK5dn vector werd getransfecteerd in PC3 cellen die atet-Off promotor construct, Ptta (Bd Biosciences) bevatten.

Western blotting

Western blotting werd uitgevoerd zoals eerder beschreven (19). Er zat tien microgram proteïne op de gel. Primaire antilichamen werden opgelost in blokkerende buffer . Een 1: 1.000 verdunning werd gebruikt voor anti-CDK5 (Sigma-Aldrich); anti-vinculine (Millipore,Upstate) werd verdund 1:4.000. Secundaire antilichamen werden verdund ata 1: 4.000 verdunning. Normalisatie van de intensiteit van de band werd uitgevoerd met de huishoudster protein vinculin. Ontwikkelde vlekken werden gescand met behulp van een Microtek scanner.

Wondgenezingsassay

Wondgenezingsassays werden uitgevoerd met confluentPC3-controle (met de lege PBI-EGFP-vector) of PC3 Cdk5dn-cellen. Een rubberen schraper werd gebruikt om een gebied van cellen af te schrapen. Lichtmicroscopische beelden werden onmiddellijk vastgelegd en 24 hafter schrapen.

small-molecule library screening

de jhdl library is eerder beschreven (13,14,17).Opslag en screening van jhdl-verbindingen werden uitgevoerd zoals eerder beschreven (17).Kort, PC3 controle en CDK5dn cellen werden gezaaid in 96-wells platen (1×103 cellen/put) en toegestaan om ‘ s nachts te hechten. Vervolgens werd 5 µl drugs, opgeslagen als voorraadoplossingen van 200 µM inDMSO / H2O, toegevoegd aan complete rpmi-media, zodat cellen werden behandeld bij een uiteindelijke concentratie van 10 µM. Na 48 uur behandeling werd 20 µl MTS-reagens van de Celtiter 96™ Aqueousniet-radioactieve Celproliferatietest aan elke cel toegevoegd voor een duur van 2-4 uur bij 37°C. De platen werden geanalyseerd gebruikend aSoftMax Pro plaatlezer (moleculaire apparaten). Proliferatie van behandelde cellen werd vergeleken met proliferatie van met DMSO behandelde PC3control-of CDK5dn-cellen (proliferatie-index). Proliferatieindices van PC3 CDK5dn-cellen werden vergeleken met de proliferatieindices van PC3-controlecellen. Er werd een PubMed-studie uitgevoerd om het klinische gebruik van potentiële hits te beoordelen.

MTS-tests

MTS-tests werden uitgevoerd om het antiproliferatieve effect van tiloronbehandeling te meten. Tiloronedihydrochloride (Sigma-Aldrich) werd opgeslagen als een 10 mM voorraadoplossing in DMSO bij -20°C. Duizend PC3-cellen werden geplateerd in 96-wells-platen met 100 µl complete RPMI-media. Bij circa 50% samenvloeiing werd tilorondihydrochloride toegediend. Forexperiments de verbinding werd verdund in volledige rpmi media toobtain de gewenste uiteindelijke concentratie. Na behandeling gedurende 72 uur (tiloron monotherapie) werd MTS-reagens toegevoegd en werd de absorptie bij 490 nm bepaald met behulp van een SoftMax Pro-plaatlezer.Proliferatieindices werden berekend; onbehandelde PC3-controle orCDK5dn-cellen (in 103 µl complete RPMI-media) werden gebruikt als acontrol. De T-tests van de Student werden uitgevoerd om de p-waarden te beoordelen.

Clonogene assays

Clonogene assays werden uitgevoerd om overleving op lange termijn na behandeling met tiloron te beoordelen. Prostaatkankercellen werden in schotels van 60 mm geplaatst en mochten zich houden. Bij 50-60% samenvloeiing,werden cellen behandeld met tiloron gedurende 72 uur. vervolgens werden 1 × 103 cellen van elke schotel geplateerd in drievoud in 60-mm schotels en geïncubeerd in volledige rpmi media gedurende 12 dagen.Kolonies werden gefixeerd en gekleurd met een oplossing die 90% methanol en 10% kristalviolet oplossing bevat (2,3% kristalviolet, 0,1% ammoniumoxalaat en 20% ethylalcohol; Sigma). Kolonies werden gescand met een computerscanner (Microtek) en handmatig geteld.De T-tests van de Student werden uitgevoerd om te beoordelen of verschillen tussen cellijnen statistisch significant waren.

3D growth assay

3D growth assays werden uitgevoerd met behulp van hetzelfde protocol zoals eerder beschreven (17). Kortom, sferoïden werden gegenereerd door het kweken van PC3 cellen voor 16 uur als een opknoping druppel over een bevochtigde plaat in een CO2 incubator in volledige rpmi media met 0,5% methylcellulose. Sferoïden werden ingebed incollageen matrix (Bd Biosciences), behandeld met tilorone, en afgebeeld met behulp van een Nikon Eclipse ti microscoop (Nikon) op de dag van de behandeling en zes dagen na de start van de behandeling. Sferoïde en totale (spheroidplus spruiten) gebieden werden gemeten met ImageJ. Vouwverhogingen werden berekend door het sferoïde/totale oppervlakte op dag 6 te delen door het scheroïde/totale oppervlakte op dag 0 voor elke individuele sferoïde. Voor elkcell lijn en tijdstip, vouw verhogingen van vier sferoïden werdenveraged. Statistische analyses werden uitgevoerd met behulp van Student ‘ St-tests.

resultaten

onderdrukking van CDK5-activiteit

PC3 prostaatkankercellen werden gekozen voor het jhdlcompound screen vanwege hun sterk gemetastaseerd potentieel enandrogeenonafhankelijkheid, waardoor ze lijken op agressieve gemetastaseerde castraatresistente prostaatkanker. De CDK5-activiteit werd geremd door overdracht en selectie van een dominant-negatieve mutatie (CDK5144N). Deze PC3 CDK5dn-cellen hadden een hoger eiwitniveau van totaaldk5 in vergelijking met de PC3-controlecellen (PC3-cellen getransfecteerd met een lege vector) (Fig. 1 bis). Awound healing assay (8) bevestigde dat CDK5 functioneel inactief was in deze cellen; in tegenstelling tot de PC3-controlecellen, hadden PC3 CDK5dn-cellen niet het vermogen om het geschraapte oppervlak binnen te dringen (Fig.1 ter).

Library screen for compounds targetingPC3 cells based on CDK5 activity

een high-throughput screening assay werd uitgevoerd om compounds te selecteren die zich richten op PC3 cellen op basis van CDK5 activity. PC3control-en CDK5dn-cellen werden gedurende 48 uur met alle verbindingen van de jhdl bij 10 µM behandeld. Om treffers te identificeren die selectief de cellen van pc3 richten op CDK5-uitdrukking, selecteerden wij alle samenstellingen waarin de verhouding van de proliferatieindex (CDK5dn / controle)onder 0.5 of boven 1.5 (Fig. 2 bis).Bovendien moesten hits de celproliferatie van PC3-cellen met minstens 10% remmen, omdat we specifiek geïnteresseerd waren in verbindingen die de celgroei (horizontale en verticale lijn in grafiek) remde. Wealso selecteerde alle samenstellingen die celproliferatie inpc3 cellen door 70% (linkerbenedenhoek van de grafiek) remde, aangezien wij in het identificeren van potentiële hoogst efficiënte antitumoragents geà nteresseerd waren. In totaal werden 41 hits geselecteerd voor verdere evaluatie.

er werd een secundair scherm uitgevoerd waarbij geselecteerde hits uit het primaire scherm bij 10 µM gedurende 48 uur werden toegevoegd aan PC3control-en CDK5dn-cellen in drievoud, om valse positiveresults te verwijderen (Fig. 2B). De cut-offwaarden waren iets minder streng dan in het primaire scherm; compounds werden als een hit beschouwd wanneer de ratio van proliferatieindices(CDK5dn/control) onder 0,7 of boven 1,4 lag. Dit resulteerde in de identificatie van drie samenstellingen die selectief pcdk5-uitdrukkende cellen richten: rutilantine, ethacridine lactaat en cetalkoniumchloride (Fig. 2C).Deze verbindingen zijn niet gebruikt als antitumor agenten en hun potentieel klinisch gebruik als intraveneuze antitumor agenten lijkt beperkt (20-23). Een andere verbinding, tiloron analogR9536-DA, was zeer effectief in het remmen van beide isogene PC3-celllijnen (>70% remming), maar het remde de proliferatie van pc3cdk5dn-cellen iets effectiever (ratio CDK5dn/control:0,687). Tiloron en zijn analogen hebben antivirale activiteit, die ten minste gedeeltelijk werken als interferon-inductoren (24-26)en er is ook preclinisch en klinisch aangetoond dat ze antitumoractiviteit hebben (27,28).

tiloron richt zich selectief op PC3-cellen met een lage CDK5-activiteit

we vervolgden onze experimenten met vers opgelostestilorondihydrochloride. Na 72 uur tiloronbehandeling in verschillende concentraties werd de IC50 vastgesteld op 8-12µM in PC3 CDK5dn-cellen en 15 µM in PC3-controlecellen in MTS-assays (Fig. 3A). Bij 8 µM nam de proliferatieactiviteit af met respectievelijk 24 en 47% in de PC3-controlecellen en Cdk5dn-cellen (p=0,001). Om de toxiciteit van innormale prostaatcellen van tiloron te beoordelen, werden MTS-tests uitgevoerd met tiloronebehandeling van menselijke prostaatfibroblasten (Fig. 3B). De gevoeligheid van deze cellen totiloron was vergelijkbaar met die van de PC3-controlecellen.

het remmende effect van tiloron in PC3-cellen werd verder beoordeeld door het uitvoeren van clonogene assays (Fig. 3C). PC3 CDK5dn-cellen waren ook aanzienlijk gevoeliger dan PC3-controlecellen voor tiloron in deze test. Behandeling met 10 µM tiloron resulteerde in een klonogenic survival van 40% in PC3 CDK5dn-cellen en 72% in PC3-controlecellen(p=0,002).

een sferoïde groeitest werd uitgevoerd om 3Dtumor groei en invasie van PC3 cellen na tiloron behandeling te beoordelen (Fig. 4). Zowel de PC3-controle als de pc3cdk5dn-cellen hadden vergelijkbare verhogingen van sferoïdgrootte over zes dagen. Nochtans, had de totale grootte (de grootte van sferoïden plus spruiten) hogere vouwverhoging in PC3 controlecellen, bevestigend datuntreated PC3 CDK5dn-cellen een verminderd invasief potentieel hadden vergeleken met PC3 controlecellen. Wanneer tilorone met 5µM werd toegediend, hadden PC3-controlesferoïden een vergelijkbaar groei-en invasief patroon als de onbehandelde PC3-controlecellen (P = 0,59) (Fig. 4B, linker grafiek). Echter, whentiloron werd toegediend in dezelfde concentratie aan PC3 Cdk5dn-cellen, een significante afname van zowel de sferoïdgrootte als de totale grootte werd waargenomen (p<0,01), wat erop wijst dat tiloron met succes sferoïdgroei en invasie van PC3 CDK5dn-cellen remt bij toediening op 5 µM (Fig. 4B, rechtergrafiek). Bij 10 µM hadden beide isogene cellijnen een afgenomen invasief potentieel.

discussie

de jhdl, een bibliotheek met goed gekarakteriseerde farmaceutische verbindingen, werd ontwikkeld om het gebruik van drugs te vergemakkelijken (29). De uitgebreide in vivo toxiciteit en farmacokinetische profielen van componenten in de bibliotheek maken een snelle verdere ontwikkeling van deze verbindingen mogelijk. Verscheidene verbindingen van het JHDL zijn gevorderd tot klinische studies voor kanker en andere therapeutische toepassingen(13,14,16,17,30–32).

in deze studie hebben we de JHDL onderzocht op componenten die de groei van kankercellen in de aanwezigheid van CDK5-remming differentieel remmen; tilorone en een tiloronanalogon werden geïdentificeerd als agenten die selectief CDK5-deficiënte pc3prostate kankercellen richten. Tilorone (Amixin IC) wordt klinisch gebruikt in sommige landen als oraal actief antiviraal middel (25). Tilorone is bij mensen getest voor de behandeling van cerebrale gliomen, laryngeale papillomatose en borstkanker (28,33,34).Hoewel antitumorwerkzaamheid werd gemeld, is de interesse in tilorone voor kankertherapie afgenomen. Onlangs rapporteerden Zhou et al nieuwe tilorone analogen met verbeterde antikankeractiviteit (35). Deze analogen kunnen veelbelovend zijn om te onderzoeken, met name in combinatie met CDK5-remming.

naast de mogelijkheid dat tiloron in combinatie met CDK5-remming kan worden bevorderd, suggereert de identificatie van tiloron als een middel dat selectief cellen met inactieve CDK5 target, potentiële klassen van geneesmiddelen om de doeltreffendheid van CDK5-remming te versterken. Tilorone is gekarakteriseerd als eeninterferon-inductor (24). Hierdoor kan interferon zelf, of een alternatieve interferonducer zoals een TLR-agonist, nuttig zijn in combinatie met een acdk5-remmer. Er kunnen echter andere mechanismen bij betrokken zijn. Bijvoorbeeld, tilorone is een DNA intercalating agent ook (24) en men kan zich voorstellen dat het chromatin structuur en genuitdrukking kan moduleren. Andere functies van tilorone, met inbegrip van signaalweg en transcriptie factorinteracties (36,37), kunnen ook worden betrokken. Er zijn verdere studies nodig om het exacte werkingsmechanisme te ontrafelen waardoorstiloron zich selectief richt op CDK5-negatieve prostaatkanker.

Dankbetuigingen

de auteurs danken professoren P. J. van Diestand E. Van der Wall voor hun steun en discussie en ProfessorsM.A. Carducci en J. T. Isaacs voor hun levering van laboratoriummaterialen. Deze studie werd ondersteund door de stewardess MedicalResearch Institute, NCI R01 CA085567, R01 CA134767, dod grantW81XWH-06-1-0139 en NCI SPORE grant P50 CA58236. M. D. W. werd ondersteund door de Dr.Saal van Zwanenbergstichting en HuygensScholarship programma.