PMC

1 gedetailleerde protocollen en tips voor het oplossen van problemen voor alle aspecten van het GST genfusion protein expression system zijn verkrijgbaar bij GE Healthcare in de handboeken: GST Genfusion System, product number 18-1157-58, and the Recombinant Protein Handbook, product number 18-1142-75. De handboeken zijn op papier te koop of als PDF te raadplegen op de website van GE Healthcare.

2 het gebruik van JM105 of een soortgelijke stam wordt aanbevolen voor het klonen en het behoud van de vector. Stammen van BL21 en zijn derivaten, of een andere protease deficiënte stam, worden aanbevolen voor maximale eiwitexpressie. Stammen met een tekort aan cytoplasmatische protease genproducten zoals lon, ompt, degP of htpR kunnen de effecten van proteolytische degradatie van overexpressed eiwit door de gastheer minimaliseren. Gebruik Geen stam van E. coli die drager is van het rec1A-allel om pgex-plasmiden te vermeerderen, aangezien schrappingen of herschikkingen van plasmide-DNA zijn gemeld.

3Glutathione Sepharose 4B bulk media wordt gebruikt in dit zuiveringsprotocol. Dit chromatografiemedium is ideaal voor screeningsomstandigheden en zorgt voor eenvoudige opschaling. De zuiveringen worden gemakkelijk uitgevoerd gebruikend of zwaartekrachtstroom of een lagedrukchromatografiesysteem, of kunnen in batchzuiveringen worden gebruikt die op centrifugatie worden gebaseerd. Gstrap FF affinity kolommen zijn 1 ml of 5 ml voorverpakte kolommen die ook beschikbaar zijn en kunnen worden aangesloten in serie voor scale-up. Deze kolommen zijn voor gebruik met een vloeistofchromatografisch systeem, een pomp, of spuit. Naast deze formaten, is glutathione Sepharose ook beschikbaar in draaikolommen en 96-well plaatformaten voor het snelle onderzoek van GST-fusie eiwituitdrukking en reinigingsvoorwaarden.

4DFP is een extreem gevaarlijk neurotoxine. Volg de door de fabrikant geleverde voorzorgsmaatregelen en behandel het neat-reagens alleen in een chemische dampkap.

5toediening van proteaseremmers aan de lysis-buffer zal helpen bij het voorkomen van proteolytische degradatie van het doeleiwit tijdens de extractie. De exacte cocktail van proteaseremmers die aan de lysis-buffer worden toegevoegd, moet echter worden afgestemd op de kenmerken van het doeleiwit. Reductiemiddelen zoals 2-ME, DTT of TCEP in concentraties van 1-10 mM moeten zo nodig aan de buffer worden toegevoegd. Toevoeging van een nietionisch detergens, zoals 1% Triton X-100, kan ook worden toegevoegd aan de buffer om te helpen bij de extractie.

6volgend is een screeningprotocol om de eiwitexpressieniveaus van fusieeiwit in miniculturen te controleren. De aanwezigheid van een toename van eiwitspiegels bij het verwachte molecuulgewicht op een SDS-pagina gel na inductie met IPTG is een goede indicatie van succesvolle eiwitexpressie. Na inductie moet een prominente band bij het verwachte molecuulgewicht (molecuulgewicht van doeleiwit + ~ 26 KDa voor het GST-deel) zichtbaar zijn. Als men vermoedt dat de proteã ne op een laag niveau wordt uitgedrukt, kan de verificatie van correcte uitdrukking worden bereikt gebruikend het westelijke bevlekken met een antilichaam specifiek voor of de doelproteã ne of GST. Als de monsters niet onmiddellijk worden geanalyseerd door SDS-PAGE, kunnen ze ‘ s nachts worden bewaard bij 4 °C of bij -20 °C voor opslag op langere termijn.

1. Ent verschillende geïsoleerde kolonies in afzonderlijke centrifugebuizen van 50 ml met 10 ml LB aangevuld met 100 µg/ml ampicilline. Kweek een nacht cultuur bij 37 °C met schudden.

2. voeg de volgende ochtend 0,5 ml NACHTCULTUUR toe aan 4,5 ml LB met 100 µg / ml ampicilline. Groei 1 uur bij 37 °C.

3. Verwijder 1 ml niet-geïnduceerd Monster. Centrifugeer en verwijder supernatant. Bevriezen of op ijs bewaren tot klaar om SDS-PAGE uit te voeren.

4. voeg IPTG toe aan een uiteindelijke concentratie van 1 mM en groei nog eens 2-3 uur.

5. Verwijder 1 ml geïnduceerd Monster. Centrifugeer en verwijder supernatant. Bevriezen of op ijs bewaren tot klaar om SDS-PAGE uit te voeren.

6. Resuspendeer de celkorrels in 200 µl SDS-pagina monsterbuffer; verwarm 3-5 min bij 90 °C.

7. analyseer 5-10 µl met behulp van SDS-pagina gevolgd door coomassie blauwe kleuring (of 1-2 µl voor Western blot).

7Samples gekweekt in miniculturen kunnen ook worden gebruikt om de oplosbaarheid van een bepaald fusie-eiwit te evalueren (Zie noot 6 voor mini-cultuur expressieprotocol). Aan het einde van de inductieperiode, oogst de cellen door middel van centrifugeren. Resuspendeer de pellet in 200 µl koude PBS. Lyse de cellen met behulp van sonication; houd het monster op ijs. Bewaar een klein aliquot van het lysaat voor analyse door SDS-pagina. Centrifugeer Het lysed monster gedurende 15 minuten. Verwijder het supernatant in een aparte buis. Resuspendeer de pellet in 200 µl PBS. Analyseer wat ruwe lysaat, het supernatant, en de geresuspendeerde pellet door SDS-pagina of het westelijke bevlekken. Als het monster wordt waargenomen in zowel de lysaat-als de supernatantfractie, is het monster voldoende oplosbaar. Als het monster voornamelijk aanwezig is in het lysaat en de geresuspendeerde pellet, is het monster het meest waarschijnlijk in occlusie-lichamen. In gevallen waar de proteã ne in inclusielichamen wordt gevestigd, onderzoekt verschillende uitdrukkingsvoorwaarden om uitdrukking aan een oplosbare vorm te verschuiven (Zie noot 8).

8als het fusie-eiwit voornamelijk tot expressie komt in inclusie-organen (bijv. > 80% onoplosbaar), kunnen verschillende strategieën worden gebruikt om de oplosbaarheid te verbeteren. Vaak, is de inductie bij lagere temperatuur (15-25 °C) efficiënt bij het verschuiven van uitdrukking van inclusielichamen aan de oplosbare fractie. Cellen geïnduceerd bij deze lagere temperatuur zullen langzamer groeien en zullen ‘ s nachts inductieperiodes vereisen. Het gebruik van alternatieve gastheerstammen of wijzigingen aan de plasmideconstructie kan in sommige gevallen noodzakelijk zijn. Als het fusieproteïne zelfs na pogingen om oplosbaar eiwit te verkrijgen, hoofdzakelijk in inclusie-organen blijft, kan het de moeite waard zijn de productie van E. op te schalen. coli en zuiveren genoeg eiwit uit de kleine hoeveelheid oplosbare eiwitten die beschikbaar is. In sommige gevallen moeten andere fusie-eiwit tags worden onderzocht.

9 Lage eiwitexpressieniveaus kunnen het gevolg zijn van zeldzaam codongebruik. In dit geval, kan het overschakelen naar een andere stam van E. coli die extra afschriften voor zeldzame codon tRNA bevat significante eiwitproductie verbeteren. Verschillende media formuleringen of toevoeging van maximaal 2% glucose kan ook de expressie verbeteren (13, 14). Als het vermoeden bestaat dat het tot expressie gebrachte eiwit toxisch is voor de cellen (meestal zullen ze stoppen met groeien na inductie met IPTG), probeer dan induceren op een later tijdstip voor een kortere tijd. Het verlagen van de iptg-concentratie is een andere optie die moet worden onderzocht.

10monitorcelgroei door het aflezen van de optische dichtheid bij 600 nm (A600). Een overnight cultuur moet een A600 ~1-1.2 bereiken. Cellen moeten worden geïnduceerd in een vroege fase van de logaritmische groeicurve voor E. coli, A600 ~ 0,5 tot 0,7. Bij 37 °C duurt het ongeveer 2 uur voordat culturen een vroeg groeistadium bereiken. Als cellen bij een lagere temperatuur worden gekweekt, moet de incubatietijd worden verhoogd, omdat de cellen bij lagere temperaturen langzamer zullen groeien. Over het algemeen zal de grootste opbrengst van fusie-eiwit worden verkregen wanneer de cellen worden geïnduceerd bij A600 = ~ 0,5. Na inductie met IPTG is een algemene richtlijn voor incubatietijd als volgt: 3 uur bij 37 °C, 5 uur bij 30 °C en gedurende de nacht gedurende 25 °C of lager. Oogst de cellen voorafgaand aan verzadiging, A600 ~ 1.0-1.2.

11om een adequate beluchting te garanderen, dienen kolven slechts te worden gevuld tot 20-30% van hun capaciteit.

12 Het is belangrijk dat er geen serineproteaseremmers aanwezig zijn in het monster vóór de splitsing met trombine of factor Xa. De volgende proteaseremmers moeten vóór de splitsing van trombine of factor Xa verwijderd worden: AEBSF, APMSF, antitrombine III, antipain, α1-antitrypsine, aprotinine, chymostatine, hirudine, leupeptine en PMSF. Bovendien is pefabloc benzamidine specifiek voor trombine en pefabloc FXa specifiek voor factor Xa. De volgende proteaseremmers moeten met Prescissieprotease worden vermeden: 100 mM ZnCl2, 100 µM chymostatine en 4 mM Pefabloc.

13er bestaan een aantal alternatieve methoden voor de detectie van GST-fusieproteïnen. Voor proteã nen die goed op een hoog niveau uitdrukken, is de eenvoudigste methode om de zuivering te controleren via SDS-pagina gels gekleurd met coomassie blauwe of zilveren vlek. Een alternatief voor proteã nen die bij lage niveaus uitdrukken moet het westelijke bevlekken gebruiken gebruikend een antilichaam dat bij of GST of de doelproteã ne wordt geleid. Een alternatief voor kleinschalige expressies is het controleren op de aanwezigheid van GST met een ELISA of CDNB enzyme assay.

14 bewaar een kleine hoeveelheid eiwitmonster van elke stap van de zuivering, met inbegrip van lysis, supernatans, pellet, ongebonden fracties van het laden van het monster, wasstappen en elutiestappen die moeten worden geanalyseerd door SDS-PAGE of Western blotting. Nadat alle monsters zijn geanalyseerd en samengevoegd, ongewenste fracties weggooien.

15 GST-eiwitten kunnen ook worden gezuiverd met behulp van een batchzuiveringsmethode. Een batch reinigingsmethode is snel, eenvoudig en vereist weinig apparatuur; nochtans, kan de resulterende proteã ne meer onzuiverheden bevatten en een lagere opbrengst dan een op chromatografie-gebaseerde reiniging hebben. Batch purifications worden het best gebruikt bij het screenen van zuiveringscondities. De hieronder beschreven batch zuivering wordt over het algemeen uitgevoerd bij kamertemperatuur. Om het risico van proteolytische degradatie te minimaliseren, kan de procedure bij 4 °C worden uitgevoerd door de incubatietijd 2 – tot 4-voudig te verhogen.

1. Lyseer cellen en verkrijg oplosbaar fusieeiwit (zie opmerkingen 8 en 21 indien het monster zich in inclusie-organen bevindt).

2. voeg 2 ml 50% slurry glutathione Sepharose bulk matrix (1 ml bed volume) per 100 ml bacteriële lysaat supernatant. Incubeer 30 min bij kamertemperatuur met zacht schudden.

3. centrifugeer 500 × g gedurende 5 min. Verwijder het supernatant en bewaar voor analyse door SDS-PAGE om de bindingsefficiëntie te bepalen.

4. was de hars met 10 bed volumes PBS. Voorzichtig resuspenderen en vervolgens 5 min centrifugeer 500 × g. Verwijder het supernatant. Herhaal was – en centrifugatiestappen voor in totaal 3 wasbeurten van elk 10 bedvolumes.

5. Elueer het fusieeiwit door de hars te resuspenderen met 1,0 ml glutathion-elutiebuffer per ml bedvolume. Incubeer 10 min bij kamertemperatuur. Centrifugeer 500 × g gedurende 5 min. Breng het fusieeiwitbevattende supernatans over in een aparte buis. Herhaal de elutie-en opvangstappen in totaal 3 keer. De bovenstaande stoffen kunnen afzonderlijk worden samengevoegd of geanalyseerd met SDS-PAGE om het eiwitgehalte te controleren (zie noot 12).

16A het bedvolume is gelijk aan de helft van de 50% – slurry van glutathione Sepharose 4B die voor reiniging wordt gebruikt. Om een 50% slurry van glutathion Sepharose te bereiden (het wordt geleverd als ~ 75% slurry): Bepaal het bedvolume dat nodig is voor de reinigingsschaal. Resuspendeer de glutathione Sepharose 4B. Pipetteer 1,33 ml van de 75% slurry voor elke ml benodigde hoeveelheid bed tot een centrifugebuis van de juiste grootte. Centrifugeer bij 500 × g gedurende 5 min. Decanteer de conciërge. Was met 10 bedvolumes (10 ml per 1,33 ml originele slurry) PBS door de buis enkele malen voorzichtig om te keren om te mengen, centrifugeer vervolgens 500 × g gedurende 5 minuten. Decanteer de conciërge. Het niet verwijderen van de ethanol-opslagoplossing kan de volgende bindingsstappen verstoren. Voeg 1 ml PBS toe voor elke 1,33 ml van de oorspronkelijke suspensie. Dit resulteert in een 50% slurry.

17glutathion Sepharose heeft een geadverteerde minimale bindingscapaciteit van 8 mg / ml. Een kolom van 20 ml moet voldoende zijn om eiwit te zuiveren uit 3 × 600 ml E. coli culturen die ~ 20-40 mg fusie-eiwit per cultuur bevatten. Zowel de hoeveelheid gebruikte hars als de kolomgrootte kunnen omhoog of omlaag worden geschaald afhankelijk van de hoeveelheid te zuiveren proteã ne.

18resuspendeer de pellet met 25-50 µl wasbuffer per ml oorspronkelijke cultuur.

19Cell verstoring is voltooid wanneer de suspensie gedeeltelijk verdwijnt en een iets donkerdere kleur krijgt. Vermijd schuimen tijdens de sonicatie, omdat dit kan leiden tot denaturatie van het fusie-eiwit. Vermijd oversonication, aangezien dit tot co-zuivering van de proteã nen van gastheer E. coli samen met de fusie proteã ne van GST kan leiden. De hoge viscositeit toe te schrijven aan versie van nucleic zuren tijdens sonication kan worden verminderd door DNase of benzoase aan de lysisbuffer toe te voegen. Lysozym tot een concentratie van 0.2 mg / ml kan worden toegevoegd als hulpmiddel bij de cellysis. Een alternatief voor sonicatie is het gebruik van in de handel verkrijgbare celextractieformuleringen. Deze producten kunnen echter merkgebonden componenten bevatten die interfereren met downstreamtoepassingen.

20indien pogingen om de expressie van inclusielichamen te verschuiven naar de oplosbare fractie mislukken, kunnen onoplosbare GST-fusieproteïnen soms worden gezuiverd in aanwezigheid van denatureringsmiddelen zoals ureum, gevolgd door refolding. Solubilisatie met behulp van detergentia zoals sarkosyl (n-laurylsarosine) is ook met succes toegepast (15, 16). Hoewel het volgende protocol met succes is gebruikt om GST-fusieproteã nen te denatureren en opnieuw van aard te maken, is elke fusieproteã neconstructie uniek en moeten de nauwkeurige denaturatie en opnieuw naturatievoorwaarden empirisch worden bepaald. De gemeenschappelijke denaturanten die met succes zijn aangewend omvatten guanidinehcl, ureum, Tween 20, CTAB, en SDS (17, 18). De denatureringsmiddelen moeten dan volledig worden verwijderd om een goede hervouwing van het eiwit mogelijk te maken. Voorwaarden die moeten worden geoptimaliseerd om refolding te vergemakkelijken omvatten: type denaturant, pH, aanwezigheid van reductiemiddel, snelheid van denaturantverwijdering en eiwitconcentratie. Zodra het eiwit opnieuw is ingesteld, controleert u of het eiwit zijn oorspronkelijke bouw en functie heeft herwonnen en verwijdert u alle onjuist gevouwen eiwitten.

1. Pre-equilibreren de glutathion sefarose kolom; soniceer de gepelleteerde E. coli cellen, en scheid de lysaat supernatant en pelletfracties door centrifugeren (zie 3.3 affiniteit zuivering van GST fusie-eiwit stappen 1-8). Resuspendeer de lysaatpellet met de inclusielichamen in 15 ml wasbuffer. Centrifugeer 20 min bij 48.000 × g (4 °C). Decanteer het supernatans en resuspendeer de gewassen pellet in 12 ml U-buffer (resuspendeer in 20 µl u-buffer per ml oorspronkelijke cultuur). Incubeer 2 uur op ijs.

2. centrifugeer 20 min bij 48.000 × g (4 °C). Breng het supernatant dat het gedenatureerde fusie-eiwit bevat over in een schone centrifugebuis.

3. voeg Triton X-100 toe aan het supernatans tot een eindconcentratie van 1%.

4. Dialyseer het monster gedurende 2-3 uur in PBS/glycerol. het volume van de dialysebuffer moet minimaal 20 keer het volume van het monster zijn.

5. Dialyseer het monster ‘ s nachts versus PBS met proteaseremmers met een buffervolume >100 maal het monstervolume.

6. verwijder het monster van de dialyse en centrifugeer 20 min bij 4000 × g.

7. geëxtraheerd en opnieuw natured proteã ne van de inclusielichamen kan nu op glutathione Sepharose kolommen worden toegepast en gezuiverd.

oplossingen:

wasbuffer: 50 mM Tris, 5 mM EDTA, 1 µg/ml leupeptin, 1 µg/ml pepstatin, 0.15 mm PMSF, pH 8,0

U buffer: 5 M ureum, 50 mM Tris, 5 mM EDTA,5 mM 2-MIJ, 1 µg/ml leupeptin, 1 µg/ml pepstatin, 0.15 mM PMSF, 1 mM DFP pH 8,0

PBS/glycerol: 1X PBS, 20% glycerol, 1% Triton X-100, 5 mM 2-MIJ, 5 mM EDTA, 5 mM 2 – MIJ, 1 µg/ml leupeptin, 1 µg/ml pepstatin, 0.15 mM PMSF, 1 mM DFP pH 7.4

21Use van een peristaltische pomp is het aangeraden om gelijkmatig control flow tarieven. Als compressie van de hars optreedt, is de druk te hoog en moet het debiet worden verlaagd.

22de bindingskinetiek tussen glutathion en GST is relatief traag. Daarom is het belangrijk om lage debieten te gebruiken om een maximale bindcapaciteit te bereiken, bijvoorbeeld 0,1 ml/min voor een I. D. kolom van 2,5 cm. Het gebruik van te snelle stroomsnelheden kan de hoeveelheid gebonden fusieproteã ne verminderen door de trage kinetiek van associatie. Was-en elutiestappen kunnen worden uitgevoerd bij snellere debieten om tijd te besparen (respectievelijk 1,5 ml/min en 0,3 ml/min). Voor monsters met grote volumes wordt de binding het meest gunstig ‘ s nachts uitgevoerd, met aanpassingen aan de stroomsnelheden zodat de kolom niet droog loopt.

23analyse van de ongebonden fracties geeft aan of het fusie-eiwit al dan niet bindend is. Als het eiwit niet wordt gedetecteerd in vroege fracties, maar verschijnt in latere fracties, geeft het aan dat de kolomcapaciteit is overschreden. Vermindering van eiwitbelasting of verhoging van de kolomgrootte zal deze voorwaarde verlichten.

24als het fusie-eiwit slecht bindt aan het Glutathionsefarose, zijn er verschillende alternatieven om de bindingsefficiëntie te verhogen. Probeer een mildere lysis methode. Als de gebruikte methode te hard is, kan de proteã ne gedenatureerd worden en, daarom, niet in staat om aan de kolom te binden. Ook, als het opnieuw natureren van de proteã ne van inclusie-organen, er zeker van zijn dat alle denaturantia uit de buffer zijn verwijderd, hetzij door uitputtende dialyse of toepassing van het monster aan een ontzoutingskolom, alvorens op de glutathionkolom aan te brengen. Verwijder de ethanol-opslagoplossing uit de glutathion Sepharose; verminder de kolom met verse glutathionbuffer gevolgd door een wasbeurt met PBS onmiddellijk vóór het laden van het monster. Verhoog de hoeveelheid hars en/of verlaag het debiet dat Voor het laden van het monster wordt gebruikt. Voeg 1-20 mM DTT toe aan het monster. Als er nog steeds een probleem is, reinigt u de kolom volgens de aanbeveling van de fabrikant. Als de binding nog steeds niet hersteld is, probeer dan verse hars te gebruiken.

25De opbrengst van fusie-eiwit kan ook worden geschat door de absorptie bij 280 nm (A280) te meten. De extinctiecoëfficiënt voor het GST-deel alleen is ~ 1,5, d.w.z. 1,00 A280 = ~ 0.6 mg / ml Eiwit, hoewel de extinctiecoëfficiënt voor het fusieeiwit gedeeltelijk zal afhangen van de absorptiekenmerken van het doeleiwit.

26als er een probleem is om het eiwit uit de kolom glutathion Sepharose te eluteren, probeer dan het debiet te verlagen en het volume van de gebruikte elutiebuffer te verhogen. Zorg ervoor dat u vers gereduceerde glutathionbuffer gebruikt (maak er de dag van gebruik van). Verhoog de glutathionconcentratie tot 40 mM en / of verhoog de pH van de buffer tot pH 8,0–9,0. Voeg 1-20 mM DTT (of een ander reductiemiddel) toe aan de buffer. De toevoeging van een nietionisch detergens kan ook solubilization verbeteren en om het even welke aggregatie minimaliseren die kan voorkomen.

27contaminatie van het gezuiverde fusie-eiwit met E. coli gastceleiwitten is een indicatie dat de sonicatie te ernstig was. Als er gedegradeerde fragmenten van het fusieeiwit aanwezig zijn, probeer dan extra proteaseremmers toe te voegen aan de lysis-buffer. Houd alle monsters, buffers en opvangbuizen koud om proteolyse te minimaliseren. Als degradatie tijdens eiwituitdrukking voorkomt, probeer het veroorzaken van de steekproef laat (~0.8 OD600) en de lengte van de inductieperiode verminderen. Overstappen op een alternatieve gastheerstam kan ook helpen.

28een alternatief voor de spijsvertering in oplossing is de protease-splitsing van fusie-eiwit terwijl het wordt gebonden aan de glutathion-Sefarosematrix. De fusieproteã ne wordt geëxtraheerd en geladen op de Glutathionsepharose gevolgd door het wassen met PBS (zie Affiniteitsreiniging van de fusieproteã ne van GST, stappen 1-11). In plaats van het eiwit met glutathionbuffer uit te elueren, wordt een PBS-oplossing die het enzym bevat op de kolom geladen en gedurende enkele uren bij kamertemperatuur (4 °C Voor Prescissieprotease) geïncubeerd. De gespleten proteã ne wordt dan uit de kolom met verscheidene kolomvolumes van PBS gewassen. Het resterende fusieproteã ne en het GST-deel kunnen uit de kolom worden verwijderd door de kolom met verminderde glutathionbuffer te wassen. De hoeveelheid enzym en incubatietijd moet voor elk fusieeiwit empirisch worden bepaald. Analyseer alle monsters per SDS-pagina om de splitsingsefficiëntie en eiwitzuiverheid te bepalen.Voeg een empirisch bepaalde hoeveelheid enzym toe aan het aan de hars gebonden fusieeiwit (Zie noot 15 a–d). Gebruik 1 ml PBS-bevattende enzym per ml bedvolume. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende enkele uren met zacht schudden. Centrifugeer 500 × g gedurende 5 minuten om de hars te sedimenteren. Verwijder de super die de doelproteã Ne aan een afzonderlijke buis bevat. Was de Glutathione Sepharose met PBS tot 3 keer om het gespleten fusieproteïne terug te krijgen. Incubeer de hars met glutathionbuffer om GST en resterende fusieproteïne te verwijderen. Gebruik 1 ml glutathionbuffer per ml hars. Centrifugeer 500 × g en recovery eluted GST. Herhaal dit tot 3 keer. Analyseer monsters door SDS-PAGE.

30indien trombineprotease wordt gebruikt, kan de spijsvertering worden uitgevoerd in de glutathionbuffer die wordt gebruikt om het eiwit uit de kolom te elueren. Als factor Xa wordt gebruikt, wordt aanbevolen om het eiwit vóór de spijsvertering te dialyseren in een Tris-buffer of PBS-buffer; glutathion huidig in de elutionbuffer kan de disulfidebruggen huidig in factor Xa verstoren die tot inefficiënte spijsvertering van fusieproteã ne leiden. Een empirische bepaling van de spijsverteringsomstandigheden voor elk fusie-eiwit moet worden bepaald in een proefexperiment met de spijsvertering. Een geschikte methode is om 100 µg fusie-eiwit over een waaier van enzym-substraat verhoudingen te verteren en de incubatietijd te variëren. Typische incubatietijden variëren van 2 tot 8 uur. aanbevolen enzym-substraat ratio ‘ s voor trombine zijn 1:100, 1:350, 1:1000, en 1:3000 (eenheden enzym per µg fusie-eiwit), en voor factor Xa zijn 1:10, 1:25, 1:50, 1:100, 1:300 (µg enzym per µg fusie-eiwit). Verwijder op het gewenste tijdstip 2 µg eiwit en stop de vertering door het monsteraliquot toe te voegen aan de buffer van het SDS-Monster. Analyseer de monsters door SDS-pagina om de optimale decollete voorwaarden te bepalen. Naast de enzyme-to-substrate ratio en de tijd, overweeg het wijzigen van bufferomstandigheden, zoals het verhogen of verlagen van de NaCl-concentratie of het toevoegen van Ca2+ aan de buffer (Zie noot 31 voor het oplossen van problemen tips).

31als meerdere banden worden waargenomen op de SDS-pagina voor het doeleiwit na de spijsvertering, controleer dan de doeleiwitsequentie voor potentiële secundaire protease-herkenningsplaatsen. Als er secundaire splitsingsplaatsen bestaan, re-clone in een andere vector. Indien geen splitsing wordt waargenomen, controleer dan de DNA-sequentie om de aanwezigheid en integriteit van de verwachte protease splitsingsplaats te controleren. Zorg ervoor dat de proteaseremmers volledig uit de buffer zijn verwijderd. Voeg meer enzym toe en/of verhoog de incubatietijd ‘ s nachts. Als de spijsvertering onvolledig blijft bij de hoogste enzyme-to-substrate ratio ‘ s en de langste tijdspunten, overweeg dan de protease-splitsingsplaats opnieuw te ontwikkelen om verschillende glycines tussen het GST-deel en het doeleiwit op te nemen om de kans op sterische hinder die de splitsing verstoort te verkleinen (19, 20).

32indien remming van het enzym na volledige spijsvertering met serineproteaseremmers ongewenst is, kan het monster op een HiTrap benzamidinekolom worden aangebracht om het enzym uit het monster te verwijderen.

33als het monster opnieuw moet worden chromatografeerd op de kolom glutathion Sefarose om GST en onverteerd fusie-eiwit te verwijderen, is het van cruciaal belang dat het verminderde glutathion volledig uit het monster wordt verwijderd. Glutathion equilibreert zeer langzaam over de dialysemembranen; als dialyseslangen met een MWCO <12.000 worden gebruikt, kunnen 3 of meer veranderingen in de buffer nodig zijn voor volledige verwijdering. Verhoogde dialysetijd (’s nachts) en een groter volume buffer kunnen ook nodig zijn voor grote monstervolumes.

34de zelfde kolom glutathion Sefarose kan worden gebruikt voor zowel initiële isolatie van het fusie-eiwit als voor repurificatie na enzymatische splitsing. Het wordt aanbevolen om een enkele kolom aan een individuele eiwitconstructie te wijden om potentiële kruisbesmetting van verschillende recombinante proteã nen te vermijden. Kolommen kunnen meerdere keren worden hergebruikt. Als de bindingsefficiëntie na verloop van tijd afneemt, reinigt u de kolom volgens de aanbevelingen van de fabrikant. Als de bindingsactiviteit niet wordt hersteld, moet een nieuwe kolom worden gebruikt.

35maximale binding treedt op als de kolom volledig is gereduceerd; echter, als de glutathion Sepharose kolom is gewassen minder dan 48 uur voorafgaand aan deze stap, deze stap kan worden overgeslagen.

36het doeleiwit bevindt zich in de ongebonden fractie en het GST en alle niet-gesplitste fusie-eiwitten binden zich aan de kolom.

37kleine monstervolumes worden aanbevolen voor een goede resolutie van doeleiwit versus andere contaminanten. Als het niet haalbaar is om het monster in een klein volume te concentreren, kunnen meerdere injecties van het monster worden uitgevoerd.