PMC

CPV-2 is het belangrijkste etiologische agens van virale gastro-enteritis bij honden. Het is een lid van de Parvoviridae familie, behorend tot de protoparvovirus genus en Protoparvovirus type 1 soorten. Het is een niet-omhulde virussen met een enkelstrengs DNA-genoom, whichencodes voor twee capside-eiwitten, VP1 en VP2, nodig voor de assemblage en verpakking van het virale genoom, evenals voor NS1 en NS2 nonstructural eiwitten, whichaid in het beheersen van DNA-replicatie, montage en regulatie van genen expressie .In de afgelopen jaren heeft CPV-2 nieuwe antigene varianten ontwikkeld. In 1980 werd de originele CPV-2-stam vervangen door de variant aangeduid type 2a (CPV-2a), in 1984 werd CPV-2b geïdentificeerd en in 2001 werd CPV-2c gedetecteerd en gerapporteerd in Italië. De laatste variant is ook geïdentificeerd in Azië, Afrika en Amerika. Vanwege het bestaan van meerdere antigene varianten voor CPV-2, kunnen de klinische symptomen sterk variëren .Vervolgens hebben dierenartsen minder zekerheid bij het geven van hun presuntieve diagnose, en meestal zijn sommige laboratoriumtests vereist om hun diagnose te bevestigen; hoewel verschillende technieken zijn ontwikkeld in onderzoekslaboratoria, zoals hemagglutinatie assays, immunofluorescentie, ELISA, PCR, immunochromatografie test en celcultuur (onder anderen), eigenlijk technieken met de grootste beschikbaarheid binnen klinische laboratoria in veterinaire hospitals zijn alleen de immunochromatografie test en PCR, echter, in het onderzoek naar de gevoeligheid en specificiteit van deze procedures, de rapporten zijn controversieel.Bovendien zijn de gevoeligheid en specificiteit van deze technieken bij patiënten met een verschillende mate van ernst van de ziekte niet uitgebreid bestudeerd.

het doel van deze studie is de voor-en nadelen van immunochromatografietest en PCR te rapporteren voor de diagnose van patiënten met een grote verscheidenheid aan klinische symptomen voor CPV-2.

deze studie werd uitgevoerd volgens de richtlijnen van de Mexicaanse officiële Norm NOM-062-ZOO-1999.

honden met klinische enteritis die waren opgenomen in het veterinaire ziekenhuis voor kleine dieren van de Universidad Autónoma de Estado de México, werden voor deze studie gescreend en geselecteerd op basis van geteste positieve of negatieve CPV-2 met behulp van geneste PCR (nPCR). Als gevolg hiervan werden 45 honden geselecteerd die positief testten en werden 5 negatiefste honden opgenomen als controlegroep. De 50 honden werden gelijktijdig klinisch onderzocht door drie dierenartsen om de gevoeligheid van de klinische diagnose te verkrijgen. Eachveterinarian gaf zijn veronderstelde diagnose op een discrete manier, met behulp van de probleemgerichte veterinaire medisch dossier (POVMR) als hun diagnostische tool.

vervolgens werden fecale monsters van alle honden geanalyseerd door middel van PCR en immunochromatografie, terwijl bloedmonsters werden gebruikt om een volledig bloedbeeld uit te voeren.

nPCR wordt beschouwd als een zeer betrouwbare en gevoelige techniek om CPV-2 virusdeeltjes te identificeren , en daarom werd in deze studie de gevoeligheid van de gebruikte tests gecorreleerd met die welke eerder werden verkregen van nPCR, voor CPV-2diagnose.

monsters van de ontlasting van honden werden verkregen met rectale swabs, die werden gesuspendeerd in nucleasevrij water en 200 µl van de homogenaten, en werden gebruikt voor het extraheren van forDNA. De procedure werd uitgevoerd met behulp van de QIAamp ® DNA-ontlasting DNA-extractiekit (QIAGEN, Mainz, Duitsland), volgens de instructies van de fabrikant. AllDNA monsters werden gekwantificeerd met behulp van een Q5000 Quawell spectrofotometer (Quawell Technology, Inc., San Jose, CA, U. S. A.). 100 ng DNA van elk monster werd gebruikt voor PCR-reacties met 50 µl eindvolume. Eerder werd in ons laboratorium een paar primers ontworpen om een 275 BP fragment te versterken,ParvoInt2FB (5′-tcaagcagatggtgatccaag-3′) en ParvoInt2CR (5′-GGTACATTATTAATGCAGTTA-3′) gelegen op nucleotiden 1.107–1.130 en 1.360–1.382 van het VP2 gen (Genbankation number FJ0051962c).

PCR-reacties werden uitgevoerd met 2 µl van elke primer (200 nM), 12,5 µl GoTaq® Green Master Mix (Promega, Madison,WI, U. S. A.) met DNA-polymerase, reactiebuffer (pH 8,5) en 400 µM van elk nucleotide (dATP, dGTP, Dctp en dTTP); 3 mM MgCl2.en 28.5 µl nucleasevrij water. Alle reacties werden uitgevoerd onder de volgende amplificatieomstandigheden: 1 cyclus bij 94°C gedurende 5 minuten voor de eerste denaturatie, gevolgd door 35 cycli bij 94°C gedurende 30 sec, 52°C gedurende 1 min, 72°C gedurende 1 min en een laatste verlengcyclus bij 72°C gedurende 5 min.

nPCR werd aanvankelijk uitgevoerd om een fragment van 1740 bp te versterken met behulp van parvoext1f (5′-ATGAGTGATGGAGCAGTTCA-3′) en ParvoExt3R (5′-AGGTGCTAGTTGAGATTTTTCATATAC–3′) primers,en werden ontworpen met behulp van de nucleotide sequenties 1-20 en 1,712-1,740 van Gen VP2 voor canine parvovirus (GenBank toetredingsnummer FJ0051962c). De reactie werd gestandaardiseerd tot een eindvolume van 50 µl.

het reactiemengsel bevatte 1 µl GoTaq® Flexi DNA-Polymerase 5 u/µl (Promega), 5 µl GoTaq® Flexi buffer 5XGreen, 3 µl MgCl2 25 mM, 4 µl dntp ‘ s 200 µM, 2 µl primers, 10µl DNA met een eindconcentratie van 100 ng en 23 µl nucleasevrij water. De reactie werd uitgevoerd onder de volgende amplificatieomstandigheden: 1 cyclus bij 94°C gedurende 5 min, gevolgd door 35 cycli bij 94°C gedurende 30 sec, 50°C gedurende 45 sec, 72°C gedurende 1 min en 1 cyclus bij 72°C gedurende 5 min. Nadien, werd 1 µl van het product van deze reactie gebruikt als malplaatje van DNA voor de het nestelen procedure, en de inleidingen en de amplificatievoorwaarden waren hetzelfde voor 275 BP fragment.

alle amplificatieproducten werden geïdentificeerd door middel van horizontale elektroforese in 2% agarose gels gekleurd met 0,5 µg/ml ethidiumbromide en gevisualiseerd met een UV-transilluminator.

voor de analyse van immunochromatografie test voor canine parvovirus (CPV Ag), de ANIGEN® kit (Bionote Inc., Gyeonggi-do, Korea) werd gebruikt. Elke test werd uitgevoerd volgens de instructies van de fabrikant.

bloedmonsters werden uit de halsader genomen met behulp van vacutainer tubes met EDTA als antistollingsmiddel. Volledige bloedceltellingen (CBC) werden uitgevoerd met behulp van eenautomatische celteller (QBC vet-IDEXX Laboratories, Inc., Westbrook, ME, U. S. A.). De bloedfilms werden bevlekt met Wright-Giemsa en onderzocht onder een fotonicmicroscoop. Leukopenie werd overwogen wanneer een totaal aantal CBC ‘ s minder was dan 6 × 103/µl .

Resultaatanalyse werd uitgevoerd met behulp van een matrix voor gecodeerde variabelen en er werden contingentietabellen opgesteld om de diagnostische testeigenschappen te bepalen . Bovendien werd in de kappa-statistiek bepaald dat de overeenkomst tussen de drie gebruikte tests en nPCR moest worden geschat. De kappa-waarde werd in 2015 gekarakteriseerd volgens Kantere en collega ‘ s, waar Kappa-waarde 1 absolute overeenstemming aangeeft, terwijl een waarde van 0 aangeeft dat er sprake is van overeenstemming door toeval. Over het algemeen wijzen Kappa-waarden hoger dan 0,6 op een goed overeengekomen niveau; de analyse werd uitgevoerd met behulp van het statistische pakket SPSS Ver. 22.0 (IBM,Inc., Armonk, NY, U. S. A.).

eenennegentig punt één (91,1) % van de positieve honden voor CPV-2 door nPCR waren raszuiver gefokt; 95.5% van de patiënten was tussen twee en acht maanden oud en 4,5% was ouder dan één jaar. Wat hun vaccinatiestatus betreft, werd 40% ten minste één keer gevaccineerd om CPV-2-infectie te voorkomen.

de frequentie van de klinische symptomen die deze honden vertoonden was als volgt: 44,4% vertoonde braken en diarree; 20% had koorts, braken en diarree(catarrale of hemorragische); 17,7% vertoonde alleen diarree; 8,8% vertoonde alleen braken; en 4,4% had diarree en koorts, en 4,4% vertoonde braken en koorts.Leukopenie werd waargenomen bij 48,8% van de honden (Tabel 1).

uit klinisch onderzoek bleek dat bij dierenartsen slechts 57,8% van de patiënten positief was voor CPV-2 en 100% van de negatieve honden; daarom werd de gevoeligheidswaarde voor klinische diagnose geschat op 57,7% (CI0.95 42,2–72) en de waargenomen specificiteit was 100% (CI0.95 46,2–98,8).Van de 100% van de honden die positief resulteerden via nPCR, waren slechts 30/45 van deze patiënten CPV-2 positief via immunochromatografie test, terwijl de vijf controlepatiënten die negatief testten op CPV-2 correct gediagnosticeerd werden. Daarom vertoonde deze techniek een gevoeligheid van 66,6% (CI0.95 50,9–79,5) en de waargenomen specificiteit was 100% (CI0.95 46,2–98,8).

bij gebruik van de PCR-techniek waren 36/45 patiënten positief op CPV-2 en de vijf controlepatiënten waren negatief bevestigd gedurende de gehele nPCR. PCR vertoonde dus een gevoeligheid van 80% (CI0. 95 63,1-87,7) en een specificiteit van 100% (CI0.95 67,8–99,1) (Fig. 1).

overeenstemming tussen de drie technieken wordt aangetoond door de kappa-waarde (tabel 2).

gastro-enteritis veroorzaakt door CPV-2 wordt beschouwd als een van de belangrijkste virale ziekten die honden beïnvloeden. Hoewel de klinische symptomen van canine parvovirus infectie kunnen variëren, waren de meest voorkomende symptomen gemeld: anorexia, depressie, lethargie, koorts ,slijm-en hemorragische diarree en leukopenie ; in subklinische gevallen kunnen sommige van deze symptomen al dan niet aanwezig zijn .

tijdens klinisch onderzoek werd variabiliteit in klinische manifestaties van infectie waargenomen. Slechts 20% van de onderzochte honden vertoonde typische symptomen zoals vaak beschreven in de literatuur. Klinische variabiliteit voor deze ziekte is eerder gemeld en sommige auteurs hebben factoren besproken , zoals leeftijd, immuunstatus, Blootstellingsroute, virale dosis, virulentie van stammen en co-infectie metandere infectieuze agentia als mogelijke oorzaken . Dit bemoeilijkt het verkrijgen van een nauwkeurige diagnose van CPV-2 Wanneer dierenartsen uitsluitend vertrouwen op hun klinisch onderzoek. Daarom, met betrekking tot ons onderzoek uitsluitend gebaseerd op deze procedure, 42.2% van de honden zal een vals-negatieve CPV-2 diagnose.Door middel van honden medische dossiers in deze studie, merkten we datveterinarians werden uitgesloten van de mogelijkheid van infectie voornamelijk omdat de honden niet de klassieke klinische symptomen beschreven in de literatuur, waren gevaccineerd tegen CPV-2 en/of waren volwassenen. De meeste honden in onze studie vertoonden echter atypische tekenen. Daarom zijn wij van mening dat subklinische infecties van CPV-2 vaker voorkomen, en dierenartsen, die moeten beslissen of ze al dan niet aanvullende diagnostische tests met een hoge gevoeligheid en specificiteit moeten gebruiken, moeten deze bevindingen serieus overwegen.

in deze studie was 40% van de patiënten die positief waren voor CVP-2 eerder geïmmuniseerd. Het is bekend dat de PCR-techniek zeer gevoelig is, en daarom detecteert hetsvaccine virusdeeltjes in feces van recent gevaccineerde patiënten; studies wijzen erop dat het mogelijk is om vals-positieve resultaten te verkrijgen van dag 3 tot 10post-vaccinatie met een gemodificeerd levend CPV-vaccin . Daarom werden patiënten met een voorgeschiedenis van vaccinatie in de voorafgaande 15 dagen uitgesloten om dit onderzoek uit te voeren. Bovendien werden monsters van gevaccineerde honden die positief waren voor CPV-2 gesequenced, en in alle onderzochte gevallen werd de genovariante CPV-2c geïdentificeerd( gegevens niet tonen), wat impliceert dat honden besmet waren met veld CPV-2c, wetende dat er nog geen CPV-2cvaccine beschikbaar is in Mexico. Bovendien, in Mexico, Pedroza en collega ‘ s gemeld dat de meest voorkomende antigene variant bij geïnfecteerde honden was CPV-2c .

anderzijds beschouwen veel dierenartsen de aanwezigheid van leukopenie, een ondersteunende factor voor de diagnose CPV-2. Echter, we zagen dat slechts 48.8% (22/45) van de onderzochte honden vertoonde leukopenie tijdens de evaluatie, wat consistent is met andere meldingen die erop wezen dat ongeveer 50% van de honden op het moment van de evaluatie Geen hematologischeteraties vertoonde . Daarom is CBC een waardevol hulpmiddel dat informatie over de ernst van de ziekte kan verstrekken, die een prognose voorstelt en de reactie op behandeling bepaalt. Leukopenie mag echter niet worden beschouwd als een diagnostisch hulpmiddel voor CPV-2, omdat het geen bewijs levert voor de aanwezigheid van het virus.

voor de definitieve bevestiging van besmetting met CPV-2 worden verschillende technieken voor virale identificatie gebruikt, bijvoorbeeld snelle tests op basis van immunochromatografie worden door artsen op grote schaal gebruikt, omdat de procedure gemakkelijk, snel en toegankelijk is. Bovendien vereist het geen monstervoorbereiding of het verzenden naar een gespecialiseerd laboratorium voor analyse. De variërende gevoeligheid van deze test is de keerzijde; verschillende studies hebben aangetoond dat de gevoeligheid varieert van 50 tot 100% , en in onze studie, de vergelijkende gevoeligheid met nPCR was 66,6%. Sommige studies hebben beweerd dat de lage gevoeligheid techniek is te wijten aan de noodzaak van een grote virale deeltjes hoeveelheden te werpen in de ontlasting van honden om een positivediagnose te verkrijgen . Het gebruik van deze techniek moet worden heroverwogen, omdat een hogere kans op vals-negatieve resultaten wordt verwacht. Om dit te voorkomen,moeten verdere technieken met hogere gevoeligheden worden gebruikt .

verschillende studies hebben de hoge gevoeligheid van PCR-gebaseerde tests aangetoond; momenteel zijn er meerdere varianten van dezelfde procedure die sensibiliteitswaarden van 80 tot 100% bieden . In de huidige studie, PCR had 80% gevoeligheid, en het is opmerkelijk om te vermelden dat patiënten alleen geïdentificeerd positief aaninfectie door middel van NPCR ondertussen noch PCR noch immunochromatografie tests waren in staat om het te identificeren.

wat de kappa-waarde betreft, hebben we de resultaten van de drie geanalyseerde methoden vergeleken met nPCR. De slechte overeenstemming tussen klinische diagnose en NPCR werd echter aangetoond; er werd een matige overeenstemming waargenomen tussen conventionele PCR en nPCR, wat te wijten kan zijn aan de gelijkenis tussen de twee tests.

wat de klinische symptomen betreft, werd de aanwezigheid van braken of diarree waargenomen bij alle viraal geïnfecteerde patiënten, terwijl andere klinische symptomen niet relevant werden geacht voor de infectie; in overeenstemming met de klinische symptomen en de gevoeligheid van de gebruikte technieken werd geen verband waargenomen. Bijvoorbeeld, geval nr. 26 toonde alleen braken als klinisch teken, en het werd negatief geacht voor CPV-2 door veterinaire klinische diagnose, echter, immunochromatografie test, PCR en npcrtesten waren positief voor CPV-2. Bovendien, gevallen 41 en 42 waarin het belangrijkste klinische teken diarree was, kon alleen positief worden gediagnosticeerd voor CPV-2 met behulp van nPCR.

uit onze gegevens blijkt dat de meest gebruikte diagnostische tests in klinische en diagnostische veterinaire laboratoria voor de detectie van CPV-2 zeer specifiek zijn, maar dat ze een zwakke gevoeligheid hebben, waardoor een nauwkeurige diagnose van CPV-2 onmogelijk is. In onze studie, waren PCR en immunochromatography test niet zo gevoelig zoals nPCR, die bevestigd was in vorige onderzoeken , nochtans, is het gebruik van nPCR als diagnosetest nog niet wijd-verspreid in veterinaire ziekenhuizen,terwijl het wijd voor onderzoeksdoeleinden blijft gebruikt.

anderzijds wordt realtime PCR, die eveneens zeer gevoelig is, zelden gebruikt vanwege de hoge kosten van de apparatuur en de behoefte aan een zeer gespecialiseerd personeel voor de behandeling ervan. Dankzij de technologische vooruitgang konden deze technieken echter goedkoper en eenvoudiger te gebruiken worden, wat ertoe kon leiden dat zij rechtstreeks in veterinaire ziekenhuizen konden worden toegepast om de diagnostische nauwkeurigheid van CPV-2 te verbeteren.