proteïne purificationEdit
Polyhistidine-tags worden vaak gebruikt voor affiniteit zuivering van polyhistidine-tagged recombinante eiwitten tot expressie gebracht in Escherichia coli en andere prokaryotische expressiesystemen. Bacteriële cellen worden geoogst via centrifugering en de resulterende celpellet wordt gelyseerd met fysische middelen of met detergenten en enzymen zoals lysozym of een combinatie daarvan. In dit stadium bevat ruw lysaat de recombinante proteã ne onder vele andere proteã nen die van de bacteriële gastheer afkomstig zijn. Dit mengsel wordt geïncubeerd met een affiniteitshars die gebonden divalente nikkel-of kobaltionen bevat, die in de handel verkrijgbaar zijn in verschillende variëteiten. Nikkel en kobalt hebben vergelijkbare eigenschappen en als ze aangrenzende periode 4 overgang metalen (v. ijzer triad). Deze harsen zijn over het algemeen sefarose/agarose gefunctionaliseerd met een chelator, zoals iminodiazijnzuur (Ni-IDA) en nitrilotriazijnzuur (Ni-NTA) voor nikkel en carboxylmethylaspartaat (Co-CMA) voor kobalt, dat de polyhistidine-tag bindt met micromolaire affiniteit. Ernst Hochuli et al. gekoppeld 1987 de NTA ligand en nikkel-ionen aan agarose parels. De hars wordt dan gewassen met fosfaatbuffer om proteã nen te verwijderen die niet specifiek met het kobalt of nikkelion in wisselwerking staan. Met Ni-gebaseerde methoden, kan de wasefficiëntie worden verbeterd door de toevoeging van 20 mM imidazol (de proteã nen worden gewoonlijk geëlueerd met 150-300 mm imidazol). Over het algemeen hebben harsen op nikkelbasis een hogere bindingscapaciteit, terwijl harsen op kobaltbasis de hoogste zuiverheid bieden. De zuiverheid en de hoeveelheid proteã ne kunnen door SDS-pagina en het westelijke bevlekken worden beoordeeld.
Affiniteitsreiniging met behulp van een polyhistidine-tag resulteert gewoonlijk in relatief zuiver eiwit wanneer het recombinant eiwit tot expressie wordt gebracht in prokaryotische organismen. Afhankelijk van stroomafwaartse toepassingen, met inbegrip van de zuivering van eiwitcomplexen om eiwitinteractie te bestuderen, kan de zuivering van hogere organismen zoals gisten of andere eukaryotes een dubbele affiniteitreiniging vereisen gebruikend twee markeringen om hogere zuiverheid op te brengen. Alternatief, single-step zuivering gebruikend geà mmobiliseerde kobaltionen eerder dan nikkelionen levert over het algemeen een wezenlijke verhoging van zuiverheid op en vereist lagere concentraties imidazole voor elution van de zijn-geëtiketteerde proteã ne.
Polyhistidine-tagging is de keuze voor het zuiveren van recombinante eiwitten onder denatureringsomstandigheden, omdat het werkingsmechanisme alleen afhankelijk is van de primaire structuur van eiwitten. Bijvoorbeeld, zelfs wanneer een recombinant eiwit met geweld uitgedrukt in E. coli produceert een inclusielichaam en kan niet worden verkregen als oplosbaar eiwit, het kan worden gezuiverd met denaturatie met ureum of guanidinehydrochloride. Over het algemeen, voor dit soort een techniek, wordt de histidineband getitreerd gebruikend pH in plaats van imidazole band—bij een hoge pH, bindt histidine aan nikkel of kobalt, maar bij lage pH (~6 voor kobalt en ~4 voor nikkel), histidine wordt geprotoneerd en van het metaalion wedijvert. Vergelijk dit met antilichaamreiniging en GST-zuivering, een voorwaarde waaraan het juiste (inheemse) vouwen van betrokken proteã NEN is. Aan de andere kant, wordt gezegd dat de His tag de neiging heeft om meer dan andere affiniteit tags samen te voegen en te insolubiliseren.
polyhistidine-tag kolommen behouden verschillende bekende eiwitten als onzuiverheden. Een van hen is fkbp-type peptidyl prolyl isomerase, die rond 25kDa (SlyD) verschijnt. Onzuiverheden worden over het algemeen geëlimineerd met behulp van een secundaire chromatografische techniek, of door het recombinante eiwit tot expressie te brengen in een SlyD-deficiënte E. coli stam. Als alternatief, in vergelijking met nikkel-gebaseerde, kobalt-gebaseerde harsen hebben minder affiniteit met SlyD van E. coli, maar in verschillende gevallen, is het matig nuttig.
eiwitten met verschillende aantallen polyhistidinetags elueren anders dan nikkelaffiniteitshars. Voor proteã nen met één enkele hexahistidinemarkering, laat 75 mM imidazole elutie van Ni-NTA toe, terwijl voor proteã nen met twee hexahistidinemarkeringen, 100 mM imidazole voor elutie wordt vereist. Deze stapsgewijze elutie kan worden gebruikt om specifieke eiwitassemblages van een mengsel, zoals gedefinieerde heteromultimers te isoleren (B.V. Een AB heterodimer van een mengsel met inbegrip van AA en BB homodimers, als slechts subeenheid B een polyhistidine-markering heeft). Een dergelijke aanpak werd gebruikt in isolatie van monovalente streptavidin.
Bindingsassaysedit
Polyhistidine-tagging kan worden gebruikt om eiwit-eiwitinteracties op dezelfde manier te detecteren als een pull-down assay. Nochtans, wordt deze techniek over het algemeen beschouwd om minder gevoelig te zijn, en ook beperkt door enkele van de meer kieskeurige aspecten van deze techniek. Zo kunnen bijvoorbeeld reductievoorwaarden niet worden gebruikt, kunnen EDTA en vele soorten detergentia niet worden gebruikt. Recente vooruitgang in dual polarisatie interferometrie is vatbaar voor EDTA en een breder gebruik van reagentia, en het gebruik van dergelijke site-specifieke tags vereenvoudigt de directe meting van de bijbehorende conformationele verandering aanzienlijk.
Hexahistadine CyDye tags zijn ook ontwikkeld. Deze gebruiken Nikkelcovalente coördinatie aan EDTA groepen in bijlage aan fluorophores om kleurstoffen te creëren die aan de polyhistidinemerk hechten. Deze techniek is getoond efficiënt om voor na eiwitmigratie en handel te zijn. Er is ook recente ontdekkingen geweest die deze techniek kunnen efficiënt tonen om afstand via fluorescente Resonantieenergie overdracht te meten.
een polyfluorohistidine tag is gemeld voor gebruik in in vitro vertaalsystemen. In dit systeem, wordt een uitgebreide genetische code gebruikt waarin histidine door 4-fluorohistidine wordt vervangen. Het gefluoreerde analoog wordt opgenomen in peptides via de ontspannen substraatspecificiteit van histidine-tRNA ligase en verlaagt de Algemene pKa van de markering. Dit staat voor de selectieve verrijking van geëtiketteerde peptiden van polyfluorhistidine toe in aanwezigheid van complexe mengsels van traditionele polyhistidinemarkeringen door de pH van de wasbuffers te veranderen.
