vergelijking tussen conventionele ontkalking en een Microgolfgesteunde methode in botweefsel met Mycetoom

Abstract

Mycetoom is een levenslange granulomateuze ziekte van subcutane weefsels en botten. Histopathologie is een onderbouwde indicatieve methode gebaseerd op de aanname van een definitieve diagnose van mycetoma. Het vereist efficiënte verwerking van weefsels met inbegrip van botontkalking. Het ontkalkingsproces moet zorgen voor volledige verwijdering van calcium en ook een goed behoud van weefsel en micro-organismen’ kleuring vermogen. Doelstelling. Om de conventionele methode gebruikt in ontkalking te vergelijken met de microgolfmethode met behulp van verschillende ontkalkingsoplossingen. Er werden verschillende kenmerken getest, waaronder de snelheid van ontkalking en morfologische en schimmelconservering in botweefsel met mycetoma. Materialen en methoden. Er werden drie ontkalkingsoplossingen gebruikt om calcium te verwijderen uit 50 met mycetoom aangetaste botweefselmonsters, waaronder 10% neutraal gebufferd EDTA (pH 7,4), 5% salpeterzuur en 5% zoutzuur. Conventionele en microgolfmethoden werden gebruikt. Haematoxyline-eosine (HE) vlek, Gridley ‘ s vlek, en Grocott hexamine-zilver vlek werden gebruikt om de bot-en schimmel morfologie te evalueren. Resultaat. De ontkalkingstijd van de conventionele methode in vergelijking met de microgolfmethode met 10% EDTA (pH 7,4) duurde 120 uur en 29 uur, terwijl 5% zoutzuur en 5% salpeterzuur afzonderlijk 8 uur en 3 uur in beslag namen. Ook 10% EDTA is de beste ontkalkingsmiddel voor hij vlekken en schimmelvlekken. 5% zoutzuur en 5% salpeterzuur kunnen worden gebruikt voor schimmelkleuring. Conclusie. De huidige studie onderzocht de effecten van verschillende ontkalkingsmiddelen en twee ontkalkingsprocedures op het behoud van de botstructuur en schimmelkleuring, die zullen helpen bij het ontwikkelen van geschikte protocollen voor de analyse van het botweefsel aangetast door mycetoma infectie.

1. Inleiding

Mycetoma is een levenslange granulomateuze, geleidelijk schadelijke epidemische ziekte van de huid en het onderhuidse weefsel, die zich kan ontwikkelen tot diepere structuren zoals spieren en botten en kan leiden tot uitgebreide vernietiging, voornamelijk van de voeten, waarvoor brede lokale chirurgische excisies of amputatie van de ledematen nodig zijn . Mycetoma wordt gedefinieerd door het driemanschap van expansie, uitputtende sinussen, en het bestaan van koloniale korrels in de inflammatoire exsudaten . Infectie is geclassificeerd als eumycetoma (schimmelinfectie) of actinomycetoma (bacteriële infectie) . Het is in grote lijnen een toestand van tropische en semitropische regio ‘ s, merkbaar Soedan . Madurella mycetomatis graangewassen zijn enorm, variërend van 0,5 tot 3 mm, en verschijnen rond, ovaal, of trilobed. Ze bestaan uit kriskras Hyphen ingeworteld in interstitiële bruinachtig cement, bestaande uit melanine-achtige, zwartbruin pigment . Histopathologie is een snelle indicatieve methode evenals voordelig proces op de veronderstelling van een definitieve diagnose van de ziekte van mycetoma en omvat een rapport dat de morfologische presentatie van de veroorzakers beschrijft. De veroorzaker kan nog steeds geïsoleerd worden van het betrokken botweefsel . De ontkalking is een fundamentele stap die algemeen voor histopathologisch onderzoek van beenderen wordt bereikt . De mineralen in botten bestaan uit calcium en fosfor, en onoplosbare zouten bestaan voor meer dan zestig procent uit botweefsel . Deze mineralen zorgen voor bothardheid en zijn de oorzaak van problemen tijdens het snijden van weefsel met behulp van roterende microtomen . Dergelijke weefsels moeten worden behandeld om calciumfosfaat te extraheren door middel van een procedure die bekend staat als ontkalking, door het weefsel voldoende delicaat te maken om door het microtoom te worden gesneden. Ontkalking wordt bereikt door zuren die oplosbare calciumzouten of chelaatvormers vormen die aan calciumionen binden. De huidige conventionele decalcifying methoden worden gekenmerkt door moeizame processen en de aanhoudende mislukking van weefsels kleuring reactie . Bij de conventionele methode van ontkalking worden botweefsels bij kamertemperatuur in een ontkalkingsvloeistof geplaatst met regelmatige tussenpozen veranderingen van de oplossing tot het eindpunt is bereikt. Microgolf ontkalking is een innovatieve techniek in vergelijking met de conventionele methode . In dit proces, worden vaste weefsels in de ontkalkingsoplossing in een magnetron geplaatst voor periodieke duur met gebruikelijke verschuivingen van de ontkalkingsvloeistoffen tot het eindpunt wordt bereikt. Microgolfstraling is uitgevoerd om de procedure van ontkalking ongeveer van dagen tot uren te versnellen . Het doel van deze studie was de conventionele methode voor ontkalking te vergelijken met de gemodificeerde microgolfmethode waarbij verschillende ontkalkingsoplossingen worden gebruikt. Er werden verschillende kenmerken getest, waaronder de snelheid van ontkalking en morfologische en schimmelconservering in botweefsel dat is aangetast door een infectie met Madurella mycetomatis.

2. Materialen en methoden

dit is een experimentele beschrijvende studie die tot doel heeft de conventionele ontkalkingsprocedure te vergelijken met microgolfversterkende ontkalking met betrekking tot weefselmorfologie die is aangetast door mycetoma-infectie met behulp van hematoxyline en eosine, Gridley en Grocott hexamine-zilvervlekken voor volledige identificatie van de causale organismen van Madurella mycetomatis. Deze studie werd uitgevoerd aan het Mycetoma Research Center in Soba University Hospital en de Faculteit medische Laboratoriumwetenschappen, Universiteit van Al Neelain. Van alle patiënten werd schriftelijke geïnformeerde toestemming verkregen. Vijftig geamputeerde ledematen met mycetoma werden verzameld. Botbiopten werden met een geschikte zaag in 5 mm dikke stukken gesneden en vervolgens gedurende 48 uur in 10% formele zoutoplossing gefixeerd. Ze werden 30 minuten onder stromend leidingwater gewassen om het fixeermiddel te verwijderen.

2.1. Conventionele ontkalkingsprocedure

drie stukken van 5 mm dikke delen van botbiopten werden ondergedompeld in drie Bekerglazen van 250 ml Pyrex Squat, die elk 100 ml 5% zoutzuur (HCl), 5% salpeterzuur (HNO3) en 10% ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA) bij kamertemperatuur (gemiddeld 28°C) bevatten, zie Tabel 1. Het eindpunt van de ontkalking werd gecontroleerd met behulp van de calciumoxalaatmethode voor de twee zure ontkalkingsmiddelen (5% HNO3 en 5% HCl) na een interval van twee uur als volgt:: 5 ml van de gebruikte ontkalkingsvloeistof werd genomen en geplaatst in een reageerbuis, vervolgens lakmoespapier werd toegevoegd, en ammoniak hydroxide werd toegevoegd druppel voor druppel totdat het lakmoespapier veranderde, wat aangeeft alkalische pH ontkalkingsvloeistof was helder. 5 ml verzadigde ammoniumoxalaatoplossing werd toegevoegd toen de ontkalkingsoplossing troebel werd, wat wijst op de aanwezigheid van calcium in het botweefsel, zodat de ontkalkingsoplossing werd vervangen door een nieuwe oplossing, en het proces werd elke 30 minuten herhaald tot de voltooiing van het ontkalkingsproces. Voor EDTA werd gebruik gemaakt van fysieke ontkalkingsproeven waarbij het ontkalkingsproces werd geacht te zijn beëindigd wanneer het bot gemakkelijk door een naald werd gepenetreerd. De gemiddelde totale ontkalkte tijd was 7 uur en 30 minuten, 8 uur en 120 uur voor respectievelijk 5% salpeterzuur, 5% HCl en 10% EDTA.

2.2. Magnetron Procedure

een huis magnetron (Midea magnetron 20L, 700W, Digital, EM720CFF) met een onroerende roterende plaat werd gebruikt. Een glazen beker met 100 ml gedestilleerd water werd gedurende 5 seconden voorverwarmd om de magnetron op te warmen. Deze werd vervangen door 100 ml vers gedestilleerd water en bestraald om de temperatuur op ongeveer 41-43°C te houden.dit duurde 15 seconden. Het glazen bekerglas werd op verschillende plaatsen in de oven bestraald om de beste plaats van het monster tijdens de microgolfontkalking op te lossen, aangezien de gebruikte microgolfoven een constante timing maar geen constante temperatuur had. Drie stukken van 5 mm dikke delen botbiopten werden ondergedompeld in 250 ml Pyrex Squat bekers die 100 ml 5% zoutzuur (HCl), 5% salpeterzuur (HNO3) en 10% EDTA bevatten. Vervolgens werden ze overgebracht naar de magnetron en werden de monsters gedurende tien cycli van elk tien seconden (met tussenpozen van 15 minuten) gedurende een totale tijd van 2-4 uur voor zure ontkalkingsmiddelen (5% HNO3 en 5% HCl) bestraald. De temperatuur van de ontkalkingsoplossing werd gehandhaafd op ongeveer 41-43°C. de ontkalkingsoplossing en het eindpunt van de ontkalking werden gecontroleerd en de ontkalkingsoplossing werd herhaaldelijk gewijzigd totdat de ontkalking was voltooid. Het eindpunt van de ontkalking werd gecontroleerd met behulp van calciumoxalaat en fysieke tests zoals hierboven vermeld. De gemiddelde totale ontkalkte tijd was 3 uur en 45 minuten, 5 uur en 30 minuten, en 29 uur en 4 minuten voor respectievelijk 5% salpeterzuur, 5% HCl en 10% EDTA. Na volledige ontkalking werden de weefsels gewassen met gedestilleerd water en gedurende 5 minuten overgebracht in 0,3% ammoniakoplossing om het gebruikte zuur te neutraliseren.

2.3. Weefselverwerking en kleuring

de monsters werden onderworpen aan automatische weefselverwerking met behulp van de volgende protocollen: de botbiopten werden gedurende een uur in 10% formele zoutoplossing geplaatst. Dan 50% alcohol een uur, 70% alcohol een uur, 90% alcohol een uur, gevolgd door 100% alcohol drie veranderingen elk twee uur elk, xyleen twee veranderingen, elk voor een en een half uur, ten slotte paraffinewas twee veranderingen elk voor twee uur. De weefsels werden ingebed in paraffineblokken en werden aan een dikte van 5-6 µm verdeeld gebruikend een roterend microtoom. Delen waren gekleurd met haematoxyline van Mayer, zoals beschreven door Mayer in 1903, en de tegenstain in elk was 1% eosine (HE) . Gridley ‘ s vlek werd gebruikt voor schimmeldemonstratie zoals beschreven door Gridley in 1953); na deparaffinisatie en rehydratie werden weefselsecties gedurende 30 minuten in 2% chroomzuur geplaatst. Ze werden vervolgens goed gewassen met kraanwater, gespoeld met gedestilleerd water en vervolgens 20 minuten in Schiff ‘ s reagens geplaatst. Vervolgens werden ze gedurende 10 minuten in stromend leidingwater gewassen en gespoeld met 70% ethanol en vervolgens met 95% ethanol. Ze werden één minuut lang met Metanilgeel gekleurd en goed gespoeld met gedestilleerd water. Vervolgens werden ze gedehydrateerd in xyleen en gemonteerd in distyreen, een weekmaker, en xyleen (DPX). Vervolgens werden de secties onder een microscoop onderzocht . Ook de Grocott hexamine-zilver methode voor schimmels zoals beschreven door Grocott in 1955 werd gebruikt in die secties werden geoxideerd met 4% waterige chroomzuur voor een uur, gewassen in water voor een paar seconden, behandeld met 1% natriummetabisulfiet voor een minuut, gewassen in stromend water gedurende 3 minuten, goed gespoeld met gedestilleerd water, geplaatst in de voorverwarmde werken zilver-oplossing in een waterbad van 60°C gedurende 20 minuten, gespoeld en in gedestilleerd water, wassen met stromend water gedurende 5 minuten, counterstained in het werken licht op groen voor 15 seconden, uitgedroogd en gewist xyleen en gemonteerd in DPX, en uiteindelijk onderzocht onder een microscoop.

2.4. Evaluatie van de resultaten

secties werden geëvalueerd door een histopatholoog. De kwaliteit van de ontkalking procedure en vlekken resultaat werden ook beoordeeld en geëvalueerd door de regel van de duim, en de kwaliteit van het ontkalken werd geëvalueerd door de volgende criteria: de tijd van ontkalking, de morfologische behoud van weefsel morfologie en Madurella mycetomatis schimmels door HIJ; Gridley en Grocott methenamine-zilver kleuring was ingedeeld van 1 tot 4 (1: slecht, 2: reële, 3: goed, 4 = uitstekend) .

2.5. Statistische analyse

gegevensanalyse werd uitgevoerd met behulp van het SPSS-programma. One-way ANOVA werd gebruikt om het effect van de drie ontkalkingsoplossingen op de kwantitatieve analyse van sectie kwaliteit en schimmel conservering te bewijzen. De Kruskal-Wallis-test werd uitgevoerd om te bepalen of er een significant verschil was tussen de geteste oplossingen voor elk van de geëvalueerde parameters samen met de twee experimenten. Verschillen met werden geïnterpreteerd als statistisch significant.

3. Resultaten

50 gevallen van Madurella mycetomatis met zwarte korrel werden in de studie opgenomen. De voeten waren het meest aangetaste anatomische gebied in 48 gevallen (96%) en twee gevallen (4,0%) in de hand. Met betrekking tot de tijd van ontkalking in verschillende experimenten, nam van de drie geteste oplossingen de ontkalking met 10% EDTA (pH 7,4) het langst in beslag voor de conventionele methode (tot 120 uur in vergelijking met 29 uur met de magnetron) en het gebruik van een zuurontkalkingsoplossing de kortste tijd in, variërend van 8 uur tot 3 uur voor verschillende ontkalkingsmethoden. De kwaliteit van de weefselmorfologie van verschillende soorten ontkalkingsoplossing met behulp van de decalcificatie microgolfmethode vergeleken met de conventionele methode met Mayer ‘ s hematoxyline en eosine kleuring met betrekking tot nucleaire en cytoplasmatische verschijning bereikte variabele resultaten. Ook bleek 10% EDTA-ontkalkt bot een significant beter resultaat te hebben (P-waarde met chi-kwadraattest: 0,023) vergeleken met 5% HNO3 en 5% HCl. Uitstekende kleuring rapport was 43 (86%) versus 32 (64%), 42 (84%) versus respectievelijk 18 (36%) en 33 (66%) versus 1 (2%). De Grocott methenamine-zilveren vlek methode werd gebruikt voor demonstratie van de Madurella mycetomatis verwekker over de morfologie en de helderheid van schimmels, en coupes ontkalkt met 10% EDTA, 5% HNO3, en 5% HCl met behulp van conventionele en magnetron methoden bleek significant beter schimmelinfectie morfologie (P-waarde met behulp van chi-square test: 0.001) als volgt: 33 (66%) versus 32 (64%), 33 (66%) versus 39 (78%) en 22 (44%) versus 31 (62%), respectievelijk. De andere schimmel vlek gebruikt voor Madurella mycetomatis was Gridley vlek over schimmelinfectie morfologie en vlekken op de kwaliteit van de botten ontkalkt met 10% EDTA, 5% HNO3, en 5% HCl met behulp van de conventionele en magnetron methoden waaruit bleek significant betere uitkomsten (P-waarde met behulp van chi-square test: 0.003) als volgt: 43 (86%) versus 41 (82%), 32 (64%) versus 34 (68%) en 23 (46%) versus 35 (70%), respectievelijk. Deze resultaten worden samengevat in Tabel 2. Figuur 1 toont de kleuringsresultaten met behulp van verschillende ontkalkingsmiddelen en condities.

figuur 1

aantonen van kleuringsresultaten met behulp van verschillende ontkalkingsmiddelen en condities.

4. Discussie

de histopathologische identificatie van het causatief agens van Madurella mycetomatis is goed vastgesteld, aangezien het de gouden standaardprocedure is; hard weefsel en bot vereisen echter speciale ontkalking om de weefselstructuur en de morfologie van het causatief agens te behouden. De veroorzakers kunnen worden geïdentificeerd met behulp van hematoxyline en eosine (HE) en schimmels speciale vlekken, zodat het bot vereist een standaard decalcificatie protocol dat weefsel, causatieve agent morfologie, en vlek vermogen bewaart. Botontkalking is een vervelende techniek. Het vereist weken, en het behoud van de weefselconfiguratie hangt van de voortreffelijkheid en de snelheid van de ontkalkingsprocedure af. Een nieuw proces met behulp van een magnetron werd gerealiseerd om het ontkalkingsproces versnellen . De selectie van het ontkalkingsmiddel en de manier wordt in principe bepaald door de ernst van de methode , en het mogelijke gebruik van microgolfenergie in histologische technieken werd voor het eerst gedocumenteerd door Mayers in 1970. Dit systeem van nonionizing emissie methode dacht te versnellen ontkalking proces . De moleculaire kinetiek veroorzaakt dan de productie van energie verandering, die duurt tot de straling stopt . In deze studie waren de voor microgolfversterkte ontkalking en de conventionele ontkalkingsprocedure gerapporteerde ontkalkingstijden respectievelijk 29 en 120 uur met 10% EDTA (pH 7,4), drie uur en zeven uur met 5% salpeterzuur en vijf en acht uur met 5% HCl. Het is duidelijk dat de microgolfontkalkingsmethode voor botweefsel met mycetoma-infectie aanzienlijk sneller was dan de conventionele methode. Ook had 5% salpeterzuur een sneller ontkalkingsvermogen, gevolgd door 5% zoutzuur en vervolgens EDTA (pH 7,4) voor beide methoden. Pitol et al. gebruikte een microgolfkoker voor het verwijderen van calcium van het rattenbot met 8,5% EDTA-oplossing en vertoonde een afname van de proefperiode van 45 dagen in het conventionele proces tot 48 uur in het microgolfproces. Bij dit werk duurde de 10% EDTA-oplossing 120 uur volgens de conventionele methode en 29 uur met behulp van microgolven om volledige ontkalking van het botweefsel dat met mycetoma-infectie is aangetast, te bereiken. De concentratie van EDTA in ons experiment was meer dan Pitol et al.’s studeerkamer. Naast verschillen in grootte, dikte en soorten van het bot, kunnen dit mogelijke verklaringen zijn voor de toename van de tijd van ontkalking in Pitol et al.’s studie die werden verminderd in onze setting. Bovendien duurde de ontkalking van het met mycetoma-infectie aangetaste bot met de conventionele methode met 5% salpeterzuur zeven uur, terwijl de magnetronmethode drie uur in beslag nam. Vergelijkbare resultaten werden bereikt door Balaton en Loget . Bovendien werden in dit onderzoek de ontkalkingstijden van andere studies verkort. De voor conventionele en microgolfmethoden gerapporteerde ontkalkingstijden varieerden van één dag en vier uur tot vijf dagen en worden als laag beschouwd in vergelijking met andere studies met knaagdierbot, die tijden hebben gemeld tussen 2 en 7 dagen met zuurontkalkingsoplossingen en 10% EDTA (pH 7,4), respectievelijk . Shibata en zijn groep rapporteerden bijna vergelijkbare ontkalkingstijden die varieerden van 1 dag tot 7 dagen met 10% HCl, 10% salpeterzuur en 10% EDTA. Ze gebruikten echter zure ontkalkingsmiddelen met hogere concentraties . Uma et al. evalueerde de effecten van vier verschillende ontkalkingsvloeistoffen met behulp van microgolfontkalking in het bot van de rat en rapporteerde 1 tot 1,5 dagen voor 5% salpeterzuur en 7% HCl/2% EDTA. Echter, 10% EDTA duurde 14 tot 26 dagen, afhankelijk van het type van het bot . In deze studies, het bottype, aard, en grootte varieerde en verschilde van die hier geanalyseerd. De ontkalkingsprocedure was een belangrijke reden voor de superioriteit van het weefselgedeelte en de precisie van het bevlekken. Philipp et al. (2019) beschreef dat de ontkalkingsmethode significante morfologische veranderingen veroorzaakt die de eiwitstructuur veranderen en het kleuringsvermogen van het weefsel beïnvloeden . In onze studie, werd het bot behandeld met 5% salpeterzuur met de routine handmatige methode, en er was zwelling in zacht weefsel en verlies van nucleaire en schimmelkleuring in vergelijking met microgolfgesteunde ontkalking. Zuur-decalciërende middelen verstoren meestal bot-en weke delen constantheid. Deze speciale effecten in 5% salpeterzuur zijn vanwege de duur en de zuurgraad van de oplossing. Snellere ontkalking zal dus grotere schade en grotere effecten veroorzaken in H&E en speciale schimmelvlekken. Verschillende schimmels kunnen worden aangetoond met een histologische sectie met behulp van histochemische vlekken, zoals de methenamine-zilver (GMS) vlek van Grocott en/of Gridley (GS) vlek . Sommige schimmels kunnen precies worden aangetoond in weefsel op basis van morfologische structuren; echter, de erkenning werkzaamheid neigde te verminderen na langdurige fixatie en ontkalking met behulp van conventionele methoden . In deze studie gaf microgolfgesteunde ontkalking superieure kleuring in vergelijking met de conventionele methode voor morfologie waarbij gebruik werd gemaakt van H&E en speciale schimmelvlek, waarbij 10% EDTA de oplossing was die weefselstructuren en schimmelkleuringscapaciteit het best bewaarde, hoewel het lang duurde voor ontkalking.

5. Conclusie en aanbevelingen

ontkalking versterkt door het gebruik van een magnetron is een nieuwe techniek voor ontkalking. Deze techniek werd onderzocht in botweefsel aangetast met madurella mycetomatis infectie met behulp van 10% EDTA, 5% salpeterzuur en 5% zoutzuur als ontkalkingsvloeistoffen. Dit werd vergeleken met conventionele ontkalking bij kamertemperatuur om de snelheid van ontkalking en weefselmorfologie te bepalen met behulp van Mayer ‘ s haematoxyline en eosine vlek voor de botstructuur en Grocott en Gridley vlekken voor schimmelmorfologie. Betere resultaten werden bereikt in vergelijking met de conventionele methode, zowel in de celmorfologie en schimmels sporen en Hyphen met verminderde schimmels helderheid bij kamertemperatuur. Deze bevinding kan helpen bij het ontwikkelen van geschikte protocollen voor de analyses van botweefsel dat is aangetast door mycetoma-infectie.

6. Beperkingen van deze studie

een grotere steekproefomvang zou meer overtuigende resultaten hebben opgeleverd. Ook zijn de tijden die voor ontkalking worden genomen waarschijnlijk verschillend als verschillende beengewichten en andere botmonsters dan handen worden gebruikt omdat de ontkalkingstijd afhankelijk is van de grootte en structurele dichtheid van het harde weefsel. Tenslotte, omdat we een huishoudelijke magnetron hebben gebruikt, kunnen onze temperatuuropnames slechts bij benadering zijn geweest.

beschikbaarheid van gegevens

de tijdens de huidige studie gegenereerde datasets zijn op redelijk verzoek beschikbaar bij de corresponderende auteur.

ethische goedkeuring

deze studie werd goedgekeurd door de Institutional Review Board van de Faculteit der medische Laboratoriumwetenschappen, Universiteit van al Neelain.

belangenconflicten

de auteur verklaart dat er geen belangenconflicten zijn.

Dankbetuigingen

de auteur wil zijn oprechte dank uitspreken aan het personeel van het Mycetoma Research Centre, Universiteit van Khartoem, Khartoem, Soedan, en speciale waardering uitspreken voor de professoren Ahmed Hassan Fahal en Ahmed Mohammed El Hassan, de emeritus hoogleraar pathologie, voor hun hulp.

aanvullende materialen

de materialen en reagentia die worden gebruikt ter ondersteuning van de bevindingen van deze studie zijn opgenomen in de aanvullende informatie. (Aanvullende Materialen)