Breve Introdução: Borrando Técnicas
Blotting é usada em biologia molecular para a identificação de proteínas e ácidos nucléicos e é amplamente utilizado para fins de diagnóstico. Esta técnica imobiliza a molécula de interesse em um suporte, que é uma membrana nitrocelulósica ou nylon. Utiliza técnicas de hibridação para a identificação dos ácidos e genes nucleicos específicos.
a técnica de blotting é uma ferramenta utilizada na identificação de biomoléculas tais como ADN ad, ARNm e proteína durante diferentes fases de expressão genética. A síntese de proteínas envolve a expressão de um segmento de ADN que é convertido em ARNm para produzir a respectiva proteína.
subtipos de blotting tais como norte, oeste & Sul dependem da molécula alvo que está sendo procurada. Quando uma sequência de DNA é a base ou código para uma molécula de proteína, a molécula de DNA particular de interesse pode ser blotada usando a técnica de Blotting do Sul. Durante a expressão do gene, quando o ADN é expresso como ARNm para uma produção de proteínas, este processo pode ser identificado pelo Northern blotting. Finalmente, o ARNm codificado produz a proteína em causa, esta identificação de proteína pode ser feita por Western Blotting.
procedimento geral de coagulação
- homogeneizar a amostra.
- separação da molécula de interesse por uma membrana electroforese.
- transferindo as moléculas para uma membrana nitro celulósica/ membrana de nylon.
- Hibridização ou a identificação da molécula
Northern Blotting
Northern Blotting é uma técnica utilizada para o estudo da expressão de genes. É feito pela detecção de RNA particular (ou ARNm isolado). o ARNm é geralmente representado como 5% da sequência global de ARN. Este método revela a identidade, número, Atividade e tamanho do gene particular. Esta técnica de blotting também pode ser usada para o crescimento de um tecido ou organismo. Em diferentes estágios de diferenciação e morfogênese a abundância de um RNA muda e isso pode ser identificado usando esta técnica. Também ajuda na identificação de condição anormal, doente ou infectada a nível molecular. A técnica northern blot foi desenvolvida em 1977 por James Alwine, David Kemp e George Stank na Universidade de Stanford. A técnica recebeu seu nome devido à similaridade do processo com o Southern blotting. A principal diferença entre estas duas técnicas é que northern blotting diz respeito apenas ao RNA.
princípio
como toda a técnica de coagulação normal, a coagulação do Norte começa com a electroforese para separar amostras de ARN por tamanho. A eletroforese separa as moléculas de RNA com base na carga dos ácidos nucleicos. A carga nos ácidos nucleicos é proporcional ao tamanho da sequência de ácidos nucleicos. Assim, a membrana electroforese separa a sequência de ácido nucleico de acordo com o tamanho da sequência de ARN. Nos casos em que a nossa sequência-alvo é um ARNm, a amostra pode ser isolada através de técnicas cromatográficas de oligo celulose, uma vez que o ARNm é caracterizado pela cauda poli(A). Como as moléculas de gel são frágeis na natureza, as sequências separadas são transferidas para as membranas de nylon. A seleção da membrana de nylon contribui para o fator que os ácidos nucleicos são negativamente carregados na natureza. Uma vez que as moléculas de RNA são transferidas, elas são imobilizadas por ligação covalente. A sonda é então adicionada, a sonda pode ser complementar uma sequência de DNA ss. A formamida é geralmente utilizada como tampão de coagulação, uma vez que reduz a temperatura de recozimento.
Procedure
- the tissue or culture sample collected is first homogenized. As amostras podem ser representativas de diferentes tipos de cultura para comparação ou pode ser para o estudo de diferentes estágios de crescimento dentro da cultura.
- a sequência de ARN é separada na unidade de electroforese.um gel de agarose é utilizado para efeitos da separação dos ácidos nucleicos.
- agora a sequência de ARN separada é transferida para a membrana de nylon. Isto é feito por dois mecanismos de ação capilar e a interação iônica.
- a operação de transferência é feita mantendo o gel na seguinte ordem. Primeiro, o gel de agarose é colocado no fundo da pilha, seguido pela membrana de blotting. Em cima destas Toalhas de papel um peso leve (placa de vidro) é colocado. Toda a configuração é mantida em um copo contendo buffer de transferência.
- RNA transferido para a membrana de nylon é então fixado usando radiação UV.
- a membrana fixa de nylon é então misturada com sondas. As sondas são projetadas especificamente para o gene de interesse, de modo que elas irão hibridizar com sequências de RNA na mancha correspondente à sequência de interesse.
- a membrana blot é lavada para remover a sonda indesejada
- a sonda marcada é detectada por quimioluminescência ou autoradiografia. O resultado será bandas escuras em filmes de raios X.
GEl e Sondas
RNA as amostras são separadas através de gel de agarose utilizando formaldeído como desnaturação de agentes, mas em pequenas RNA ou micro RNA sequências, sequências de poliacrilamida com uréia como uma desnaturação agente também pode ser usado. Brometo de etídio pode ser usado como agente de coloração. Dois tipos de marcadores são para marcação de tamanho. Uma escada de RNA e subunidade ribossômica são usadas para a identificação do tamanho das sequências de RNA.As sondas podem ser complementares à totalidade ou parte do RNA de interesse. Podem ser RNA, DNA ou oligonucleótidos de 25 basepairs complementares ao RNA-alvo. No caso de sondas de RNA, sondas produzidas pelo invitro são usadas como sondas de invivo podem desnaturar devido à Lavagem rigorosa. No caso do cDNA, as sondas são rotuladas com isótopos radioativos, fosfatase alcalina ou peroxidase de rábano silvestre em caso de quimioluminescência.
