o ensaio de TUNEL é mais comumente usado para detectar células submetidas a apoptose, que é uma forma de morte celular programada. Apoptose é um importante processo biológico durante o desenvolvimento, e para a manutenção da homeostase tecidular. A coloração de TUNEL permite a visualização e quantificação de células apoptóticas. Isto ajuda os cientistas a testar a eficácia de novos tratamentos para doenças nas quais a apoptose é inibida, como no cancro, ou aumentada, como na neurodegeneração.
este vídeo explicará como o ensaio de TUNEL pode ser usado para rotular células submetidas a apoptose, um protocolo passo-a-passo para realizar este método em seções tecidulares, e como os pesquisadores estão aplicando esta técnica para entender mecanismos de morte celular.Antes de entrar no protocolo do ensaio de TUNEL, vamos discutir os princípios por trás desta técnica.
uma das muitas características marcantes da apoptose é a fragmentação do ADN. Como ocorre a fragmentação do DNA? A apoptose é realizada por enzimas chamadas caspases presentes no citosol. O seu papel principal é a clivagem de proteínas para desmantelar a célula. Além disso, as caspases activam uma enzima chamada DNase activada pela caspase, ou CAD, separando-a do seu inibidor—ICAD. A CAD activada é uma endonuclease que viaja para o núcleo e separa o ADN cromossómico. A clivagem do ADN causa a acumulação de fragmentos de ADN com extremidades cortadas, e o ensaio de TUNEL marca fluorescentemente estas extremidades picadas de ADN fragmentado, permitindo aos cientistas detectar apoptose. Mas como é que isto aconteceu? Para isso você tem que entender a reação de TUNEL. TUNEL é o nome dado à rotulagem dUTP nick-end mediada pela desoxinucleotidil transferase terminal. Os dois reagentes principais do TUNEL são desoxinucleotidil transferase terminal, ou TdT, e trifosfato de desoxiuridina, ou dUTP, que pode ser fluorescentemente etiquetado para facilitar a detecção.
a fim de entender a reação de TUNEL, vamos voltar para as células apoptóticas com fragmentos de DNA. Estes fragmentos têm grupos hidroxila de 3′ livres. Uma vez que você adiciona os reagentes de TUNEL a uma amostra contendo células apoptóticas, os dUTPs marcados fluorescentemente se ligam a estes grupos 3′ hidroxila com a ajuda da enzima catalisador TdT. As células manchadas usando este procedimento são chamadas células positivas de TUNEL, que podem então ser visualizadas usando microscopia de fluorescência.Agora que você entende os princípios básicos e conceitos por trás do ensaio de TUNEL, vamos delinear um protocolo geral para executar esta técnica em seções de tecidos. Os principais passos do ensaio de TUNEL incluem a fixação do tecido de interesse, a permeabilização do tecido, a adição de reagentes de TUNEL, a interrupção da reação de TUNEL e, finalmente, a análise.
em primeiro lugar, o tecido de interesse deve ser fixado a fim de preservar as estruturas biológicas. A fixação funciona através da ligação cruzada de proteínas dentro das células. Para o ensaio de TUNEL, os tecidos podem ser fixados adicionando-os a uma solução contendo 4% de paraformaldeído durante 4-24 horas a 4°C. Após fixação, criossecção do tecido em fatias finas de 10 µm ou menos.
o próximo passo é a permeabilização, que permite que reagentes como a enzima TdT penetrem o núcleo celular. A permeabilização das secções dos tecidos pode ser efectuada adicionando o tecido à solução de proteinase K durante 5-15 minutos a 37°C. Lavar as secções dos tecidos com tampão fosfato salino num agitador orbital durante 15-30 minutos à temperatura ambiente.
após a permeabilização, a enzima TdT e os dUTPs marcados fluorescentemente são adicionados às secções tecidulares, juntamente com um tampão de rotulagem contendo cobalto que actua como cofactor para a reacção ao TUNEL. Em conjunto, incubam-se a mistura de reacção de TUNEL e a secção tecidular durante 1-3 horas a 37°C e protegem-se da luz para evitar que a fluorescência se desvaneça.
após incubação, adiciona-se o tampão de paragem à secção tecidular para cessar a reacção ao TUNEL e, após uma incubação curta, lavam-se as secções com solução salina tampão de fosfato. Por último, as secções dos tecidos manchadas com dUTP marcado com fluorescência são visualizadas através de microscopia de fluorescência e avaliadas para a localização de células positivas do TUNEL dentro de um determinado tecido. Pode-se quantificar a morte celular simplesmente contando a porcentagem de células positivas de TUNEL em uma dada seção de tecido.
agora que você viu como realizar o ensaio de TUNEL para detectar células apoptóticas, vamos discutir como este ensaio pode ser usado para abordar questões feitas por biólogos de células.
a morte celular ocorre como uma parte normal do desenvolvimento para a escultura de tecidos e estruturas, e para a eliminação de células desnecessárias. Portanto, os cientistas interessados neste fenômeno estudam o efeito da exposição pré-natal a diferentes substâncias na apoptose durante o desenvolvimento. Aqui, os cientistas estavam interessados em examinar o efeito da exposição pré-natal ao álcool no desenvolvimento cerebral. Os resultados da coloração de TUNEL realizados em cérebros fetais revelaram aumento da apoptose em tecidos que foram pré-natalmente expostos ao álcool, em comparação com animais de controle.
os cientistas também utilizam o ensaio de TUNEL para investigar a apoptose em resposta a infecções bacterianas. Neste experimento, os cientistas desenvolveram um modelo de pneumonia injetando ratos com Pseudomonas aeruginosa, que induz inflamação pulmonar. Em seguida, o tecido pulmonar foi removido e a coloração de TUNEL foi realizada para examinar a apoptose em resposta à infecção bacteriana. Os resultados mostram que a morte das células apoptóticas aumentou nos ratinhos expostos às bactérias, em comparação com os animais de controlo.
por último, a coloração de TUNEL pode ser usada em amostras de tumores humanos, a fim de determinar a capacidade de resposta do tumor às drogas. Neste exemplo, Amostras de tumor foram colhidas de pacientes humanos e ex vivo cultivados. Em seguida, foram tratados com fármacos pré-clínicos e avaliados quanto a uma resposta utilizando o ensaio de TUNEL. Os dados obtidos mostram que o tratamento com um fármaco que inibe a proteína 90 do choque térmico aumenta significativamente a apoptose no tecido tumoral.Acabou de ver o vídeo do JoVE sobre a utilização do ensaio de TUNEL para detectar células submetidas a apoptose. Este vídeo revisou os princípios por trás da coloração de TUNEL, e um protocolo passo-a-passo para realizar o ensaio de TUNEL em seções de tecido. Também revisamos como este método pode ser aplicado para entender a morte celular programada durante o desenvolvimento e a doença. Como sempre, obrigado por assistir!
